黑豆与黄酒共制女贞子炮制工艺优化

蒋云秀，东宝花，敖明月，胡 麟，胡昌江，陈志敏，余凌英

（成都中医药大学药学院，西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137）

女贞子为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实，具有滋补肝肾、明目乌发的功效，临床常用于治疗肝肾阴虚、眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明、内热消渴、骨蒸潮热等，而黑豆可用于预防心血管疾病、治疗糖尿病、抗炎症、改善骨质疏松等［1］。女贞子生品性凉，临床应用时有轻微腹痛、腹泻等不良反应［2］，需加以炮制［3］，如黄酒制可缓和其寒性，黑豆汁制可协同增强其补肝肾、抗氧化等作用［4］，传统炮制方法为黑豆与其共蒸，但因时间较长、工艺参数无量化标准、大生产筛选繁琐，限制了其传承发展［5］。因此，本实验采用星点设计-响应面法，通过“性状-成分-药效” 多维评价优化黑豆与黄酒共制女贞子炮制工艺，以期为该药材规范化生产和临床应用提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Thermo 2018 型高效液相色谱系统（美国Thermo 公司）； BP110S 型电子分析天平（十万分之一，德国Sartorius 公司）； DHS-10A 型快速水分测定仪［邦西仪器科技（上海） 有限公司］； DHG-9240 型电热鼓风干燥箱（上海索谱仪器有限公司）； HH-S8 型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）； KQ-300E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 红景天苷（批号CHB20101）、特女贞苷（批号CHB201213）、女贞苷G13 （批号CHB210106）、2，2 联苯基-1-苦基肼基 （DPPH，批号CHB210105）、2，2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，批号AA0400） 对照品均购自成都克洛玛生物科技有限公司，纯度均大于98%。黄酒购自绍兴市抱龙山有限公司； 黑豆购自农贸市场（大粒绿心黑豆）。女贞子（批号D2110016、D2010050、D220526） 购自四川省新荷花中药饮片股份有限公司，经成都中医药大学药学院胡昌江教授鉴定为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实。过硫酸钾（2021110101）。乙腈、磷酸均为色谱纯； 其余试剂均为分析纯； 水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 炮制品制备

2.1.1 传统方法 取100 g 女贞子，加入20 g黄酒，拌匀，闷润，加入等量黑豆粒，隔水蒸制一段时间，取出，干燥，重复9 次，即得。

2.1.2 优化方法 取100 g 女贞子，加入适量黄酒和黑豆汁隔水蒸制一段时间，取出，干燥，重复1 次，即得。

2.1.3 黄酒黑豆汁制备方法 取100 g 黑豆，加水煎煮2 次，第1 次4 h，第2 次3 h，过滤，合并滤液，得250 mL 黑豆汁，晾凉后加入20 mL 黄酒，即得。

2.2 外观评价标准建立 根据成品性状结合2020年版《中国药典》，以表面色泽、质地、气味为评价指标［6］，具体见表1。

表1 女贞子外观评价标准Tab.1 Appearance evaluation criteria for Ligustri lucidi Fructus

2.3 醇溶性浸出物含量测定 参考2020 年版《中国药典》，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法，以30%乙醇为溶剂，要求不得少于25%。

2.4 含量测定 采用HPLC 法。

2.4.1 色谱条件 Kromasil 100-5-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脱（0 ～10 min，10% 乙腈； 10 ～60 min，10% ～40%乙腈）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃；检测波长275 nm； 进样量5 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 对照品溶液制备 精密称取红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13 对照品适量，50%甲醇定容至刻度，制成质量浓度分别为0.078、2.26、1.52 mg/mL 的溶液，即得，在4 ℃下保存。

2.4.3 供试品溶液制备 精密称取1.0 g 女贞子粉末（过3 号筛），置于锥形瓶中，精密加入25 mL 稀乙醇，称定质量，密塞，超声提取40 min，取出，放冷，稀乙醇补足减失的质量，静置，取适量上清液，3 000 r/min 离心20 min，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4.4 方法学考察

2.4.4.1 线性关系考察 精密吸取不同体积对照品溶液，50%甲醇稀释，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.4.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液适量，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13 峰面积RSD 分别为0.38%、0.91%、1.35%，表明仪器精密度良好。

2.4.4.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液（S1），于0、4、8、12、24、48 h 在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定，测得红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13 峰面积RSD 分别为1.97%、1.27%、0.62%，表明溶液在48 h 内稳定性良好。

2.4.4.4 重复性试验 精密称取药材（S1） 6 份，按 “2.4.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定，测得红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13 峰面积RSD 分别为1.03%、1.70%、0.75%，表明该方法重复性良好。

2.4.4.5 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的药材粉末0.01 g，置于锥形瓶中，精密加入对照品适量，按“2.4.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13平均加样回收率分别为101.73%、100.84%、97.89%，RSD 分别为2.89%、2.34%、2.28%。

2.5 抗氧化活性研究

2.5.1 供试品溶液制备 同“2.4.3” 项。

2.5.2 DPPH 法 参考文献［7］ 报道，精密称取DPPH 2.75 mg，置于100 mL 量瓶中，无水乙醇溶解定容，制成质量浓度为0.027 5 mg/mL 的溶液。取“2.4.3” 项下供试品溶液1 mL，与3 mL DPPH溶液混匀，避光反应30 min，在517 nm 波长处测定吸光度A，以样品溶剂调零校准，计算DPPH 清除率，公式为清除率＝ ［1- （A1-A2） /A3］ ×100%，其中A1为1 mL 供试品溶液与3 mL DPPH溶液混合室温避光孵育30 min 后吸光度，A2为1 mL供试品溶液与3 mL 无水乙醇混合室温避光孵育30 min 后吸光度，A3为1 mL 稀乙醇与3 mL DPPH 溶液混合室温避光孵育30 min 后吸光度。

2.5.3 ABTS 法 参考文献 ［8］ 报道，ABTS溶液由ABTS （3.84 mg/mL） 与过硫酸钾（1.34 mg/mL） 等体积混合而成，避光放置12 h，使用时用无水乙醇稀释至吸光度为0.70 ± 0.02。取“2.4.1” 项下供试品溶液0.2 mL，与3.8 mL ABTS 溶液混匀，避光反应5 min，在734 nm 波长处测定吸光度A，以样品溶剂调零校准，计算ABTS 清除率，公式为清除率＝ （1-As/Ab） ×100%，其中Ab为3.8 mL ABTS 溶液＋0.2 mL 样品溶液吸光度，As为3.8 mL ABTS 溶液＋0.2 mL 样品溶液吸光度。

2.6 权重确定 参考文献［9］ 报道，采用层次分析法（AHP）。

浸出物是质量控制的重要指标，而特女贞苷、红景天苷、女贞苷G13 为女贞子中含量较高、具有变化趋势的成分。同时，特女贞苷、红景天苷作为2020 年版《中国药典》 女贞子质量控制的指标成分，在炮制过程中可发生转化； 女贞苷G13 含量较高，并具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等药理作用［10-11］。因此，本实验选择醇溶性浸出物、特女贞苷、红景天苷、女贞苷G13 含量作为评价指标。

将3 个影响因素分为3 个层次，4 个评价指标分为4 个层次，确定重要程度依次为成分＞药效＞性状、红景天苷含量＞女贞苷G13 含量＞特女贞苷含量＞醇溶性浸出物含量，采用1～9 标度法对其进行两两比较以评判重要性［12-13］，构建成对比较优先判断矩阵，见表3～5。

表3 各层次评分标准Tab.3 Scoring standards for various levels

表4 性状、成分、药效成对比较优先判断矩阵及权重系数Tab.4 Priority judgment matrices and weight coefficients for pair comparison of characters，components and efficacy

表5 评价指标成对比较优先判断矩阵及权重系数Tab.5 Priority judgment matrices and weight coefficients for pair comparison of evaluation indices

根据评分结果，测得性状、成分、药效一致性比例因子（CR） ＝0.008 9＜0.1，而红景天苷、女贞苷G13、特女贞苷、醇溶性浸出物含量CR ＝0.011 6＜0.1，均符合一致性检验，表明权重系数合理有效。

2.7 黑豆与黄酒共制女贞子工艺优化

2.7.1 单因素试验

2.7.1.1 辅料 传统炮制方法是女贞子与黑豆共蒸，但两者难以区分，筛选起来耗时费力，而且九制女贞子耗时较长，不适宜大生产，故本实验选择黑豆汁。

2.7.1.2 蒸制时间 随着蒸制时间延长，红景天苷含量升高，女贞苷G13、特女贞苷含量先升后降，在60 min 时最高，结合蒸制次数，本实验选择60 min。

2.7.1.3 蒸制次数 随着蒸制次数增加，红景天苷含量升高，女贞苷G13、特女贞苷含量呈动态变化，在第5 次时最高，故本实验选择5 次。

2.7.1.4 烘制温度 随着烘制温度增加，红景天苷含量升高，特女贞苷、女贞苷G13 含量降低，综合考虑，本实验选择80 ℃。

2.7.2 星点设计-响应面法 在单因素试验基础上，以蒸制时间（A）、蒸制次数（B）、烘制温度（C） 为影响因素，设计三因素五水平试验，因素水平见表6。

表6 星点设计-响应面法因素水平Tab.6 Factors and levels for central composite designresponse surface method

然后，以外观性状，红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13、醇溶性浸出物含量，DPPH、ABTS 自由基清除率的总评 “归一值” （OD 值） 为评价指标［14-15］，公式为OD＝0.539 0×［0.465 8×Y1/Y1max＋0.277 1×Y2/Y2max＋0.161 1×Y3/Y3max＋0.096 0×Y4/Y4max］ ＋0.297 3× ［0.5×Y5/Y5max＋0.5×Y6/Y6max］ ＋0.163 8×Y7/Y7max，其中Y1～Y7分别为红景天苷、女贞苷G13、特女贞苷、醇溶性浸出物含量，DPPH、ABTS 自由基清除率，外观性状，Y1max～Y7max为其最大值，结果见表7。

表7 星点设计-响应面法设计与结果Tab.7 Design and results for central composite design-response surface method

采用Design Expert 8.0 软件对表7 数据进行二次多元回归拟合，得方程为OD ＝0.80 ＋6.50A＋1.88B＋0.02C-1.39AB-8.29AC＋4.59BC＋9.97C2，方差分析见表8。由此可知，模型P＜0.05，具有高度显著性； 失拟项P＞0.05，表明该模型可用于预测分析； 烘制温度具有显著影响（P＜0.05）。响应面分析见图2。

图2 各因素响应面图Fig.2 Response surface plots for various factors

最终确定，最优工艺为黑豆熬汁约250 g 后加入20 g 黄酒，拌入100 g 女贞子中，隔水共蒸70 min，取出，在90 ℃下烘干，拌入黑豆汁与黄酒再蒸，重复7 次。

2.7.3 验证试验 取3 批药材（批号D2110016、D2010050、D220526），按“2.7.2” 项下优化工艺进行验证试验，结果见表9。由此可知，该工艺稳定可行（RSD＜3%）。

表9 验证试验结果（n＝3）Tab.9 Results for verification tests （n＝3）

3 讨论与结论

2020 年版《中国药典》 仅收载了女贞子和酒女贞子，而黑豆与黄酒共制女贞子在古籍中记载较多，不仅能减少其不良反应，还可增强其滋补肝肾作用，但耗时较长，不适宜现代化生产，故本实验采用星点设计-响应面法探索更规范化、数据化的炮制工艺。现代研究表明，女贞子中红景天苷、特女贞苷、女贞苷G13 具有抗炎、抗氧化、调节免疫等药理活性［16-19］，故本实验以性状、成分和药效为指标，结合层次分析法确定其权重，避免主观化对结果的影响，发现最优工艺下上述指标与传统炮制方法相似，在某些方面甚至更优，可实现特色炮制品的数据化生产［20-21］。

综上所述，本实验不仅为女贞子现代化生产提供了依据，还通过建立“性状-成分-药效” 多维关联的炮制工艺优化方法来为其他中药炮制品提供了借鉴。今后，将进一步探索女贞子特色炮制品的药效物质变化情况，深入挖掘其作用机制，以期更有利于相关临床应用和产品开发。