蛋白多肽美拉德反应物稳定乳液的研究进展

王美月，布冠好，常永锋，赵晓玲

（河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

乳液是由两种或两种以上不相容的液体组成的分散体系，广泛应用于食品工业中，如牛奶、黄油、奶类饮料、冰淇淋等的加工[1]。然而，乳液在加工、储存或消耗过程中经常会出现不稳定现象（图1），这些现象限制了乳液在食品工业中的应用[2]。因此，寻找合适的乳化剂和乳化方法，制备均匀稳定的乳液具有重要的实际意义。

图1 乳液不稳定的现象Fig.1 Different phenomena of emulsion instability

蛋白多肽通常含有2～20 个氨基酸残基，分子质量一般小于6 kDa[3]，与蛋白质相比，多肽具有更好的生理活性，其渗透性、溶解性及乳化性也较高[4]。通过蛋白质的酶法改性可以制备蛋白多肽，此方法通过限制性地破坏蛋白分子中的肽键，打开蛋白质的折叠结构，使疏水基团暴露出来，既能有效地提高其界面吸附性能，也能使其两亲性能得到显著增强[5]。虽然这些蛋白多肽作为乳化剂能有效地形成乳液，但在稳定乳液方面效率较低，因为它们形成稳定表面膜的能力有限，易形成絮凝和聚结的乳液[6]。研究发现利用美拉德早期反应对蛋白多肽进行糖基化修饰[7]，可以有效增强蛋白多肽的乳化能力[8]。美拉德反应是一种非酶反应，在高温下，还原糖与食物中蛋白质的游离氨基反应形成不同的糖共轭化合物，这些产物异构化形成Amadori重排化合物，包括Schiff碱（图2）[9]。新的糖偶联物不仅会增强食品的功能性[10-12]，且多糖吸附在油水界面，能够降低界面张力，形成稳定的液滴。

图2 美拉德反应初始阶段反应原理[9]Fig.2 Reaction principle in the initial stage of the Maillard reaction[9]

美拉德反应对蛋白多肽乳液的稳定性具有促进作用。因此，本文将对蛋白多肽美拉德反应物形成乳液的稳定机制、理化特性、功能特性、影响乳液稳定性因素及其在递送体系中的应用进行详细阐述，旨在为构建稳定的蛋白多肽乳液及扩宽其在生物活性物质中的应用方面提供思路和参考。

1 蛋白多肽美拉德反应物稳定乳液的作用机制

1.1 影响乳液稳定性的相互作用

乳液在制备和储存过程中，在各种条件下（如极端pH值、高盐离子浓度、高温等）容易失稳，影响乳液稳定性的相互作用一般分为两类：空间位阻作用和静电相互作用[13]。

空间位阻是影响乳液稳定的主要因素，它与乳液体系的界面性质密切相关（图3A）。在乳液形成过程中，乳化剂吸附在液滴的油水界面上，形成稳定的乳液[14]。不同类型的乳化剂形成不同的界面层厚度，这对液滴间空间位阻的强度有很大影响，当乳化剂形成的界面层具有足够的厚度时，乳化液会因受到强大的空间排斥力而稳定[15]。然而，当乳液液滴的外部壳层较薄时，形成的空间位阻作用较弱，无法维持乳液的稳定性，易导致乳液失稳。其中重力分离和Ostwald熟化现象的发生就是由于乳液不稳定造成的。

图3 影响乳液稳定性的空间位阻作用（A）和静电相互作用（B）Fig.3 Steric effects (A) and electrostatic interactions (B) affecting the stability of emulsions

当液滴的界面强度不足时，静电相互作用对乳化液的稳定性起关键作用（图3B）。静电斥力的强度与液滴的电荷密度和离子强度有关，一旦静电相互作用减弱，乳液就会变得不稳定[13]。在这种情况下，聚结和絮凝是乳液失稳的主要现象，此时液滴间相互吸引的作用（范德华力、疏水性和电荷的耗尽）大于相互排斥作用（如空间斥力和静电斥力），聚结作用使小液滴的界面层破裂，之后融合在一起形成较大的液滴[16]。

1.2 美拉德反应对蛋白多肽乳液稳定性的影响机制

蛋白质水解会使其分解成小分子的多肽，并提高其溶解度，从而更有效地被界面层吸收[17]。同时，随着水解液中游离氨基数量的增加，乳液表面张力降低，变得更加稳定[18]。但是，由于蛋白多肽在界面上的吸附较差，且空间位阻较弱，其稳定的乳液在长期储存和极端条件下表现出的性能并不理想[19]。与糖类物质进行美拉德反应能够提高蛋白多肽的功能特性[20]，蛋白多肽-糖类美拉德反应物稳定乳液的形成过程如图4所示，此过程不仅能够改善由于蛋白多肽分子质量过小而引起的乳化性不足的现象，还可以提高蛋白多肽扩散到油水界面上的速率[21]。蛋白多肽具有较快的界面吸附动力学速度，能有效地增强糖类物质在界面上的吸附，从而形成较厚的空间位阻层，提供静电斥力，阻止液滴聚集[22]，增强乳液的稳定性。

图4 蛋白多肽-糖类美拉德反应物的乳液形成过程Fig.4 Formation process of emulsions stabilized by Maillard reaction products from protein-derived peptides and carbohydrates

2 蛋白多肽美拉德反应物稳定乳液的理化特性

一般来说，粒径大小是影响乳液稳定性的重要指标，粒径越小的乳液对液滴聚集和重力诱导的相分离的抵抗力越强，也越稳定[21]。当乳液液滴间具有较高的Zeta电位时，静电排斥力较大，乳液较稳定[23]。孟新宇[24]利用壳聚糖糖基化酪蛋白肽作为乳化剂制备稳定的乳液，发现当复合物亲水亲油平衡值为12时，乳液的Zeta电位绝对值最大，平均粒径最小，此时的乳液最稳定。Pan Yi等[18]发现乳清蛋白水解物与糊精之间的共价交联会提高油滴周围界面膜的乳化性能和物理稳定性，有利于形成较小尺寸的液滴，此外，所有样品的多分散指数均不高于0.208，表明油滴在乳液中分布均匀。乳液液滴之间具有较强的静电排斥作用，可以抑制乳液发生乳析、絮凝及聚结。以脱酰胺玉米蛋白肽-多糖美拉德反应物为乳化剂制备乳液，发现Zeta电位绝对值随着反应时间的延长而增大[25]。因此，美拉德反应能够改善蛋白多肽稳定乳液的粒径和Zeta电位，且粒径越小，Zeta电位绝对值越大，乳液越稳定。

蛋白多肽的美拉德反应可以影响蛋白质的内部结构，进一步影响其乳化特性。Liu Lili等[26]利用紫外吸收光谱和傅里叶变换红外光谱分析证实，酶解和糖基化可破坏卵清蛋白的球状结构，形成紧密有序的网状结构，增加与水和油的接触面积，从而改善蛋白质的乳化性。Du Qiwei等[27]利用激光共聚焦扫描显微镜观察到经过高温杀菌后，油滴和蛋白质均匀分布在乳清蛋白水解物-果胶稳定的乳液中，乳清蛋白水解物与果胶具有较高的接枝度，能够抑制蛋白质变性和聚集，从而提高乳液的热稳定性。

3 蛋白多肽美拉德反应物稳定乳液的功能特性

利用蛋白多肽与糖类物质进行美拉德反应制备的乳液具有较好的功能特性，如界面特性、乳化特性、流变学特性、抗氧化性、冻融稳定性等[28-30]。

3.1 界面特性

界面张力常被用来表征乳化剂的界面特性[31]，美拉德反应通过改变蛋白多肽的界面张力进而影响乳液的稳定性。侯楚楚[32]发现酪蛋白肽与阿拉伯胶形成的接枝物能够显著降低界面张力，且水解度较低的酪蛋白肽形成的接枝物在界面层能形成机械强度更高、黏弹性更好的界面膜。葡聚糖使玉米醇溶蛋白多肽的表面疏水性降低了53%，随着葡聚糖的加入，乳液液滴大小和吸附量均减小，且与蛋白多肽相比，共轭复合物降低了气水界面张力，提高了复合物的乳化性和乳化稳定性[33]。研究发现蛋白多肽美拉德反应物具有较高的表面活性，有利于增强乳液的稳定性。

3.2 乳化特性

蛋白质水解后在极端条件下乳化稳定性会有所降低，糖类物质可以通过空间位阻作用显著提高其乳化性[34]，因此，美拉德反应可以进一步提高蛋白多肽稳定乳液的乳化性和乳液稳定性。Regan等[28]利用酪蛋白酸钠水解物与麦芽糊精进行美拉德反应，结果表明，结合多肽通过空间稳定性在液滴表面形成了更大的聚合层，形成的乳液具有更好的乳化性能。乳液的乳化性和稳定性也受水解度和糖分子质量的影响，低水解度下的受控酶解可导致蛋白质分子的展开，在界面上产生表面活性多肽，并使蛋白质的微观结构更加灵活，具有柔性结构的生物聚合物容易失去其三级结构，疏水基团直接指向界面的非水侧，从而有利于吸附，提高乳液的稳定性[35]。Zhang Jinbo等[36]将β-伴大豆球蛋白与葡聚糖在干热美拉德反应下进行偶联，再经胰蛋白酶水解，发现低水解度的偶联物有较高的乳化性和表面疏水性，可以有效地防止乳液发生桥联絮凝。糖类物质的引入可使蛋白多肽的亲水性提高，空间位阻增大，从而能够防止油滴聚集。为了增加乳化性能，将胰蛋白酶部分水解的玉米醇溶蛋白与分子质量为2.5 kDa和6 kDa的葡聚糖进行美拉德反应，发现与分子质量2.5 kDa的葡聚糖偶联的水解产物性能改善最大，且美拉德反应降低了玉米醇溶蛋白水解物的表面疏水性和界面张力，提高了乳化性和乳化稳定性[33]。因此，利用蛋白多肽与糖类物质进行美拉德反应制备的乳液具有较好的乳化特性，且与糖类物质的分子质量和水解度密切相关。

3.3 流变学特性

乳液的流变性和表观黏度会影响乳液中油滴的平均尺寸和分布以及乳液的动力学稳定性[37]。蛋白质水解物的表观黏度相比于蛋白质有所降低，可能是小肽分子沿流动方向空间扩散和重排的结果[38]。美拉德反应能够有效改善蛋白多肽的流变特性。Cermeño等[19]发现浓缩蛋白水解物乳液在储存过程中弹性模量值降低，结构弱化，出现乳液失稳现象，而将浓缩乳清蛋白水解物与卡拉胶偶联制备的复合物乳液在储藏期间更稳定，其表观黏度增加，粒子间碰撞减少，稳定性增强。于勇[39]发现马铃薯蛋白水解物-葡聚糖共聚物乳液表观黏度大于由马铃薯蛋白制备的乳液，这表明马铃薯蛋白水解物-葡聚糖共聚物有效降低了乳液聚集现象的发生。由此可知，蛋白多肽美拉德反应物稳定乳液具有较高的黏弹性，能够增强油水界面处物质间的相互作用力，有利于乳液的长期稳定性。

3.4 抗氧化性

美拉德反应产物具有较强的清除和猝灭自由基的能力，且产物中的羟基、还原吡咯和呋喃基团可以提供具有抗氧化活性的氢原子[40]。Pan Yi等[18]利用乳清蛋白水解物和线性糊精进行糖基化反应形成结合物，发现与共轭物稳定乳液相比，水解物稳定乳液在14 d的储存期间氢过氧化物含量明显增长。由于美拉德反应产物的抗氧化机制是清除自由基和螯合金属离子[41]，因此，吸附在界面上的共轭物可以螯合过渡金属，清除溶解在水相中的自由基，从而抑制脂质氧化。而且，含有长链糊精的结合物能够阻止自由基链式反应，保护乳液中的油免受氧化[42]。综上，蛋白多肽美拉德反应产物具有较强的自由基清除能力和金属螯合能力，在递送生物活性时能起到抗氧化的作用，有效提高生物活性物质的利用率。

3.5 冻融稳定性

冷冻保藏是延长食品保质期和保持其质构属性最常用的处理方法之一[43]。然而，环境压力会对蛋白质乳液稳定性产生影响，如冻融循环可能导致蛋白质乳液不稳定，严重限制了蛋白质在冷冻食品中的应用[44-45]。王喜波[46]和Wang Yuying[47]等将大豆蛋白酶解物与葡聚糖美拉德反应物稳定的乳液经过3 次冻融循环后发现，大豆分离蛋白酶解物-葡聚糖共聚物稳定的乳液没有出现明显的桥联絮凝现象，相比于大豆分离蛋白-葡聚糖共聚物稳定的乳液，具有更好的冻融稳定性。酪蛋白水解物和羧甲基壳聚糖偶联的水包油纳米乳液经冻融处理后粒径分布均匀，比酪蛋白纳米乳液的油滴更不容易聚结[48]，这可能是由于蛋白质水解后球形结构的数量减少，界面处展开肽结构的构象灵活，促进了黏弹性界面层的形成[49]。Yu Jie等[50]以大豆蛋白酶解物和葡聚糖的复合物为乳化剂制备的乳液经3 次冻融循环后，发现其乳液脱油率、粒径、絮凝度和聚结度均小于大豆蛋白-葡聚糖复合物的乳液，且冻融处理后大豆蛋白水解物和葡聚糖复合物形成的乳液更稳定。综上，美拉德反应处理后的蛋白多肽稳定的乳液具有较好的冻融稳定性，可作为冷冻食品的有效乳化剂。

4 蛋白多肽美拉德反应物乳液稳定性的影响因素

4.1 内部因素

4.1.1 水解度

蛋白质的酶解暴露了多肽的疏水区域，增加了多肽的分子柔性，从而了改善蛋白的乳化性[51]。然而，较高的水解度可能会产生大量的游离氨基酸和短肽链，延迟多肽在油水界面上的吸附，降低其乳化性，同时，深度水解后的产物具有不良风味，如苦味、涩味[52]。Hou Chuchu等[53]以酪蛋白疏水肽为修饰剂，通过干法美拉德反应改善酪蛋白的乳化特性，结果表明，当水解度为1.5%时，乳液粒径最小，在储藏期间最稳定，且偶联物的乳化能力是阿拉伯树胶的46 倍，乳化稳定性是阿拉伯树胶的21 倍。Ding Yue等[29]将大豆蛋白水解物和麦芽糊精进行干法糖基化反应，结果表明当大豆蛋白水解度为8%时，乳液的液滴尺寸较小，大多数液滴团簇较小，这防止了液滴絮凝，显著提高了乳液稳定性，因此，适度的水解有利于乳液的稳定。Regan等[28]将酪蛋白酸钠通过有限、中度和高度水解得到3 种产物，分别与麦芽糖糊精进行干法美拉德反应，在形成乳液时，每种共轭复合物稳定乳液的平均脂肪球大小均小于相应的水解物稳定乳液，经过7 d储存后，有限和中度水解的美拉德反应共轭复合物稳定乳液储存稳定性有所提高。由此可知，水解度是影响蛋白多肽形成乳液的重要因素之一，可以通过调节蛋白质的水解度提高乳液的稳定性。

4.1.2 糖分子质量

近年来，有研究证明糖分子质量大小也能影响美拉德反应对蛋白多肽的改性。Li Weiwei等[54]研究了糖链长度对大豆蛋白水解物美拉德反应物乳液稳定性的影响，结果表明，乳液的稳定性随着糖链长度的增加而增加，由于大豆肽-葡聚糖复合物紧密排列，在油水界面处形成了较厚的吸附层，为絮凝提供了空间位阻。齐明[55]利用苦荞蛋白水解物与不同分子质量的糖类（葡萄糖、麦芽糊精、葡聚糖）进行美拉德反应，发现苦荞蛋白水解物与葡聚糖反应的复合物稳定的乳液具有最小的粒径和最大的Zeta电位绝对值，复合物不仅具有较好的乳化活性和乳化稳定性，其稳定的乳液也具有更好的稳定性。同样的，利用葡萄糖、麦芽糊精、葡聚糖对豌豆蛋白水解物进行改性，在所有糖类中，葡聚糖和豌豆蛋白水解物偶联制备的乳液稳定性最好[56]。由此可知，随着糖分子质量的增加，乳液液滴的外部壳层厚度增加，空间位阻作用增强，乳液的稳定性提高。此外，葡聚糖具有较大的分子质量，能最大程度地修饰蛋白水解物的空间结构，显著改善水解物的乳化性，因此，研究中常利用蛋白多肽-葡聚糖美拉德反应物制备稳定的乳液。

4.1.3 反应时间

美拉德反应能够提高乳液的稳定性，但过度反应会导致其乳化能力下降。Xu Jing等[41]用碱性蛋白酶制备黑豆蛋白水解物，再与葡萄糖进行湿法糖基化反应，孵育时间为1～6 h，结果表明，黑豆蛋白水解物-葡萄糖偶联物在孵育4 h时，不仅乳化活性和溶解性提高，其还原力和羟自由基清除率也有所增强。马双双[57]研究了玉米蛋白水解物和半乳糖反应3 h和6 h得到的糖基化反应物的功能特性，发现当反应时间为6 h时，复合物的乳化性最好、泡沫稳定性最强，说明充分反应使蛋白质疏水基团暴露出来，亲油基团增多，乳液的稳定性提高。张亚婷[58]比较了大豆蛋白酶解物与麦芽糊精的不同反应时间（120、180、240、270、300 min）对乳液稳定性的影响，发现当反应时间为270 min，乳液的粒径较小，而到300 min时，乳液粒径显著增大，这表明此阶段的酶解接枝产物乳化能力有所下降，可能是由于美拉德反应进行到后期阶段产生了大分子聚合物，影响了反应物的溶解性，从而导致其乳化能力出现一定程度的下降。

4.2 环境因素

许多类型的大分子乳化剂都会受到环境的影响，如在极端条件下（极酸性或极碱性pH值、高盐离子浓度、高温等）会失去乳化能力[59]。Arsa等[60]研究了不同pH值（7～10）对米糠蛋白水解物-果糖美拉德反应产物乳液的影响，发现随着pH值的增加，乳液乳化性和乳化稳定性逐渐增强，pH值为10时，美拉德反应最快，乳化能力最强，这与蛋白质分子的展开有关。美拉德反应物具有较强的空间位阻效应，酪蛋白水解物和羧甲基壳聚糖经美拉德反应制备的偶联物稳定的纳米乳液在pH 4.0条件下没有出现絮凝物，而酪蛋白稳定的纳米乳液出现了许多絮凝体，且在酸性pH值条件下，相比单独吸附的酪蛋白，偶联物的吸附层为纳米乳液提供了更有效的空间位阻作用，显著提高了纳米乳液的稳定性[48]。侯楚楚[32]发现单独的酪蛋白肽在酸性乳液中非常不稳定，加入NaCl后，酪蛋白肽在贮存过程中乳液平均粒径增大，在相同离子强度的体系中，酪蛋白肽-阿拉伯胶接枝物所形成的水包油乳液在储存28 d后，平均粒径的增大幅度明显减小。阿拉伯树胶与β-乳球蛋白稳定的乳液在4 ℃保存4 周，表现出较高的物理稳定性，这可能是由于低温抑制了液滴的运动速度，导致乳液的迁移率降低，乳液液滴之间的相互吸引力减弱，从而防止了油相分离[61]。在热处理过程中，停留在界面上的蛋白质水解物变性，表面电荷损失，样品的Zeta电位绝对值急剧下降[59]，Drapala等[62]将乳清蛋白水解物和麦芽糊精进行湿法接枝，发现偶联物在经过热处理（95 ℃、15 min）后Zeta电位绝对值增大，表现出较好的稳定性。因此，美拉德反应提高了蛋白多肽稳定的乳液在极端条件下的稳定性。

5 蛋白多肽美拉德反应物稳定乳液的应用

许多生物活性物质在应用过程中易出现水溶性差、化学稳定性差、生物利用率低等问题[63]。基于对食品中生物活性物质的包封、保护和释放优势，蛋白多肽美拉德反应物及其乳液递送体系在食品工业中受到了广泛的关注[64]，表1总结归纳了此方面的相关文献。图5展示了蛋白多肽美拉德反应物稳定乳液包埋生物活性物质的过程。总地来说，由蛋白多肽与糖类物质进行美拉德反应得到的产物稳定的乳液体系可以有效地包封和保护生物活性物质、提高生物活性物质的稳定性、促进钙离子的吸收、提高活性物质的抗氧化活性及生物利用率等。

表1 蛋白多肽美拉德反应物在递送体系中的应用Table 1 Application of Maillard reaction products from proteinderived peptides in delivery systems

图5 蛋白多肽美拉德反应物稳定乳液包埋生物活性物质的过程Fig.5 Process for the encapsulation of bioactive substances in emulsions stabilized by Maillard reaction products from protein-derived peptides

6 结语

乳液对活性物质的递送作用是目前食品领域研究的热点之一，蛋白多肽美拉德反应物稳定的乳液具有较好的理化特性和功能特性，能够有效地递送生物活性物质，提高其生物利用率。研究发现，蛋白多肽美拉德反应物稳定乳液会受到水解度、糖分子质量、反应时间、环境等多种因素的影响，然而，目前该乳液的作用机制并不完善，需要进一步研究不同肽段对反应过程的影响，也可利用物理或化学方法辅助美拉德反应过程，制备更加稳定的蛋白多肽美拉德反应物乳液，同时通过体外消化实验、细胞实验和动物实验验证乳液在递送生物活性物质方面的应用效果。