元宝枫油对衰老果蝇生理指标及肠道菌群的影响

李秀娟，魏晶晶，柴学军，刘亚飞，黄俊朗，刘 伟，陈树林，朱晓岩，赵善廷,*

（1.西北农林科技大学动物医学院，神经生物学实验室，陕西 杨凌 712100；2.西安医学院基础医学部，基础医学研究所，陕西 西安 710021；3.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100）

元宝枫是一种集观赏、生态、木材、食用和药用等多种价值于一体的多功能树种，作为我国特有树种，适应性强，耐寒耐旱耐贫瘠，广泛分布于甘肃、河北、内蒙、东北等地[1]。从元宝枫果实中提炼出来的元宝枫籽油品质优良，油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸占总量的90%以上[2-3]。元宝枫籽油中含功能性脂肪酸——神经酸，因首先在动物大脑中发现而得名，是一种二十四碳原子单不饱和脂肪酸，神经酸在大脑中含量丰富，是神经元的重要组成成分，在大脑发育中具有重要作用，并可促进神经损伤的修复、改善神经退行性疾病症状[4-5]。元宝枫油中神经酸质量分数高达5%，这使得元宝枫成为了提取神经酸的主要木本植物，促进了元宝枫的开发和利用[6]。研究表明，元宝枫籽油可调节肠道菌群[7]，增强小鼠机体免疫力[8]，改善因高脂膳食引起的小鼠脂质代谢紊乱[9]，改善脂多糖诱导的小鼠肠道炎症[10]；提高大鼠的运动耐受、抗疲劳、抗氧化损伤能力[11]；同时具有抗菌[12]及抗肿瘤作用[13]。2011年，经国家卫生健康委员会批准，元宝枫籽油成为新资源食品，这标志着元宝枫籽油的研究与开发利用进入了新的阶段，为开发以元宝枫油为原料的功能性食品提供了政策保障。

果蝇（Drosophila melanogaster）生命周期短、繁殖能力强[14]、饲养方便、遗传背景清晰、与人类有70%的同源基因[15]，在抗衰老研究中具有独特的优势。本实验以果蝇为模式生物，筛选元宝枫油最适添加剂量，进行寿命观测及爬行、嗅觉记忆和热刺激等行为学实验，测定其抗氧化能力和对肠道菌群的影响，评价元宝枫籽油的抗衰老和抗氧化作用，以期为元宝枫油后续的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生型黑腹果蝇W1118，由西北农林科技大学动物生殖调控与繁殖障碍性疾病防控研究团队提供。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号20200623）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（批号20200623）南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

恒温生化培养箱 宁波东南仪有限公司；高温灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；超净工作台 北京亚太克隆公司；高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；QIAamp DNA Stool Mini Kit 德国QIAGEN公司；FC型酶标仪 美国赛默飞仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基制作

元宝枫油（山东枫之神生物科技有限公司刘恺然先生惠赠）主要成分根据实验室前期研究确定[16]。基础培养基的制备：玉米粉10 g、蔗糖8 g、酵母粉1.5 g、琼脂1 g，以上材料混匀后倒入120 mL蒸馏水，加热并不断搅拌直至沸腾，煮沸后静置4 min，加入0.4 mL丙酸，继续搅拌，直至冷却。将培养基倒入高12 cm、直径3 cm经高温灭菌的玻璃试管中，培养基厚度约3 cm。培养基需倒置于干燥实验室内24 h以上。元宝枫油培养基的制备：在基础培养基中加入不同剂量元宝枫油，制成含10、20、40 g/kg元宝枫油的药培养基。

1.3.2 寿命实验

实验方法参考相关文献[17]。收集8 h内羽化的果蝇，每组各200 只，雌雄各半，随机分为对照组和给药组，给药组使用给药培养基饲养，对照组使用基础培养基饲养，置于温度（25±5）℃、相对湿度（50±5）%、光照周期12 h的智能培养箱中培养。每天观察计数死亡的果蝇数量，每3 d更换一次培养基，直至果蝇全部死亡。计算果蝇平均寿命。

1.3.3 生长发育实验

收集对照和给药组30 d的果蝇，每组10 只，称取果蝇的质量，每组重复10 次。

1.3.4 攀爬实验

收集对照组和给药组10、20 d和30 d的果蝇，每组20 只，雌雄各半，装入试管后计数15 s内从试管底部爬过8 cm标线的果蝇只数，每组重复10 次。

1.3.5 嗅觉记忆实验

收集对照组和给药组30 d的果蝇，每组20 只，雌雄各半，将待测果蝇放入空管内饥饿处理2 h，放入1000 mL的烧杯中。烧杯中提前放置2 个50 mL带孔且装有香蕉的离心管，其中一个离心管为无障碍离心管，果蝇可闻到气味，也可通过孔洞进入采食；另一个为有障碍离心管，果蝇可闻到气味，无法进入采食。每隔1 h记录进入无障碍离心管的果蝇数量，连续记录8 h，每组重复5 次。

1.3.6 热刺激实验

收集对照组和给药组30 d的果蝇，每组100 只，雌雄各半，将待测果蝇装入空管中，放入37 ℃培养箱中高温处理30 min，移出后正常培养24 h，记录果蝇的死亡数量，每组重复3 次。

1.3.7 抗氧化能力测定

收集对照组和给药组30 d的果蝇，每组100 只，雌雄各半，称取果蝇质量，加入预冷的生理盐水研磨，收集组织匀浆后使用SOD试剂盒和GSH-Px试剂盒测定SOD、GSH-Px活力，使用过程中严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.8 果蝇肠道菌群样本采集

收集10 d和30 d的果蝇，CO2麻醉后用体积分数75%的酒精冲洗，解剖前用4 ℃、1×磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3 次。在体视镜下解剖分离收集果蝇中肠。用于菌群分析的每个样品至少包含30 个果蝇的中肠（雌雄各半），每组重复10 次。

1.3.9 DNA提取、聚合酶链式反应扩增、测序

样品保存于-80 ℃，使用QIAamp DNA Stool Mini Kit 提取肠道DNA。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量和浓度，使用引物515 F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806A（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）扩增16S rRNA的V4区域。测序步骤由Magi基因技术公司进行。

1.3.10 16S rRNA测序与分析

细菌16S rRNA基因的原始序列数据由Illumina MiSeq PE250生成，使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology2（QIIIME2，version 2019.10）对序列进行进一步分析。通过DADA2进行降噪，获得扩增子序列变异（amplicon sequence variants，ASVs）。采用RDP Bayes-Classifier对每个具有代表性的16S细菌基因序列进行分类分析，置信阈值为80%。

1.4 统计分析

使用OASIS 2软件对Kaplan-Meier生存曲线进行统计分析，其他统计分析使用GraphPad Prism 9X软件进行。双尾学生t检验用于两个样本之间的其他比较，Tukey检验进行单因素方差分析用于多重比较。

2 结果与分析

2.1 元宝枫油对果蝇寿命的影响

如图1所示，与对照组相比，不同剂量的元宝枫籽油干预均能显著延长果蝇的平均寿命（P＜0.0001）。对照组果蝇的平均寿命为30.41 d，而添加10、20、40 g/kg元宝枫油组果蝇平均寿命分别为37.49、39.85、37.23 d，说明20 g/kg元宝枫油添加对延长寿命效果最佳，平均延长寿命31%，因此，后续实验均采用20 g/kg剂量添加元宝枫油。

图1 元宝枫油对果蝇寿命的影响Fig.1 Effect of A.truncatum seed oil on lifespan of D.melanogaster

2.2 元宝枫油对果蝇生长发育的影响

为了研究元宝枫油对果蝇生长发育的影响，称量了成年果蝇的体质量。在雌性果蝇中，与对照组相比，10、20、40 g/kg的元宝枫油干预对果蝇体质量无显著影响（P＞0.05）（图2A）。在雄性果蝇中，元宝枫油对体质量也无显著影响（P＞0.05）（图2B）。

2.3 元宝枫油对果蝇运动能力的影响

果蝇具有反趋地性行为，据此特点设计的爬行实验可以反映其运动能力。随着日龄的增加，果蝇的攀爬能力降低，表明其运动性能的降低。如图3所示，10 d时，对照组与元宝枫油组果蝇攀爬能力无显著差异（P＞0.05）；20 d时，元宝枫油组攀爬能力显著高于同期对照组（P＜0.001）；30 d时，元宝枫油组攀爬能力也显著高于同期对照组（P＜0.001），表明元宝枫油明显改善了衰老果蝇的运动能力。

图3 元宝枫籽油对果蝇爬行能力的影响Fig.3 Effects of A.truncatum seed oil on crawling ability of D.melanogaster

2.4 元宝枫油对果蝇嗅觉学习记忆能力的影响

学习记忆作为机体的高级功能，一直是神经系统抗衰老研究的重点。在该实验中，果蝇能将奖赏性的香蕉奖励和香蕉气味偶联，形成学习记忆。如图4所示，与对照组10 日龄年轻果蝇相比，30 日龄衰老果蝇进入无障碍离心管果蝇数量明显减少（P＜0.05），说明衰老会引起嗅觉记忆能力受损。与正常30 日龄衰老果蝇相比，元宝枫油饲喂能显著增加30 日龄果蝇进入无障碍离心管的果蝇数量（P＜0.05），其进入无障碍离心管的果蝇数量与正常对照组10 日龄年轻果蝇相似，说明元宝枫油能明显改善老年果蝇的嗅觉学习记忆能力。

图4 元宝枫籽油对果蝇嗅觉记忆能力的影响Fig.4 Effect of A.truncatum seed oil on olfactory memory capacity of D.melanogaster

2.5 元宝枫油对果蝇热耐受能力的影响

热应激实验检测果蝇在热刺激下的存活率，可以反映其对高温的耐受能力和环境适应能力。如图5所示，与对照组10 日龄年轻果蝇相比，30 日龄衰老果蝇的存活率显著降低（P＜0.0001），表明老年果蝇的热耐受能力明显降低；与正常30 日龄衰老果蝇相比，元宝枫油组30 日龄果蝇的存活率显著提高（P＜0.001），说明元宝枫油能提高果蝇的热耐受能力。

图5 元宝枫籽油对果蝇热耐受能力的影响Fig.5 Effect of A.truncatum seed oil on heat tolerance capacity of D.melanogaster

2.6 元宝枫油对果蝇抗氧化能力的影响

SOD和GSH-Px作为机体内重要的抗氧化酶，其活性可以体现机体抗氧化能力。如图6所示，与对照组10 日龄年轻果蝇相比，30 日龄衰老果蝇的SOD和GSH-Px活力显著降低（P＜0.001），表明老年果蝇体内抗氧化能力明显降低；与30 日龄老年果蝇相比，元宝枫油组果蝇体内SOD和GSH-Px活力均显著提高（P＜0.001），几乎和10 日龄年轻果蝇相同，表明元宝枫油饲喂能提高衰老果蝇体内的抗氧化能力。

图6 元宝枫籽油对果蝇抗氧化能力的影响Fig.6 Effect of A.truncatum seed oil on antioxidant capacity of D.melanogaster

2.7 元宝枫油对果蝇肠道菌群的影响

2.7.1α多样性分析

α多样性分析可以反映微生物群落的丰度和多样性。采用3 种方法比较10 日龄年轻果蝇、30 日龄老年果蝇和元宝枫油饲喂的30 日龄老年果蝇的肠道菌群α多样性，Chao1指数主要显示肠道菌群种类的多少，Shannon指数和Simpson指数两者算法不同，但都是综合肠道菌群中细菌物种多寡和丰度均匀性的指标，物种越多、均匀度越一致，则Shannon指数和Simpson指数越高。如图7所示，与10 日龄的年轻果蝇相比，30 日龄老年果蝇的肠道菌群Chao1指数显著降低（P＜0.05），表明随着机体衰老肠道菌群种类显著降低。而与30 日龄老年果蝇相比，元宝枫油饲喂后30 日龄老年果蝇的Chao1指数显著升高（P＜0.05），这表明元宝枫油饲喂改善了衰老引起的肠道菌群种类下降。Shannon指数和Simpson指数的分析结果显示，与10 日龄的年轻果蝇相比，30 日龄衰老果蝇的肠道菌群Shannon指数和Simpson指数均显著升高（P＜0.001），元宝枫油干预无显著变化，这表明衰老虽然降低了果蝇肠道微生物的物种丰富度（Chao1指数显著降低），但使肠道微生物均匀度趋于一致。元宝枫油干预使衰老果蝇的肠道微生物丰富度和均匀度趋于年轻果蝇。

图7 果蝇肠道菌群α多样性分析和比较Fig.7 α-Diversity analysis and comparison of gut microbiota in D.melanogaster

2.7.2β多样性分析

β多样性是对不同样品/不同组间样品的微生物群落构成进行比较分析。为了定量比较不同年龄及元宝枫油干预之后果蝇肠道菌群的变化，采用主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）法评估了不同组中果蝇肠道微生物的β多样性。首先计算不同样品之间的Bray-Curtis距离，基于距离的特征值和特征向量排序，从多维数据中提取出最主要的元素和结构。为了更直观比较不同组间的菌群结构组成差异，选取贡献率最大的PCo1和PCo2进行展示（图8）。同组中重复样本间距离近，肠道微生物组成均明显聚类，其中PCo1和PCo2分别占方差的59%和19%，30 日龄衰老果蝇组与10 日龄年轻果蝇组样本之间距离远，而元宝枫油干预组的30 日衰老果蝇组与对照组的10 日年轻果蝇组距离较近，表明衰老果蝇肠道微生物群落结构发生了较大改变，元宝枫油具有调节衰老果蝇肠道微生物群落结构向年轻组过渡的作用。

图8 果蝇肠道的β多样性分析和比较Fig.8 β-Diversity analysis and comparison of gut microbiota in D.melanogaster

2.7.3 线性判别（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析

LEfSe分析可以展示不同组别肠道菌群变化，发现组间差异物种。如图9所示，30 日龄衰老组中，差异菌种有3 种，分别是Enterobacteriaceae、Gluconobacter、Morganella morganii，表明它们可能是衰老的关键靶菌。

图9 果蝇肠道菌群LEfSe分析Fig.9 LEfSe analysis of gut microbiota in D.melanogaster

2.7.4 Enterobacteriaceae、Gluconobacter和M.morganii的相对丰度分析

对以上发现的3 种衰老相关差异菌种进行了相对丰度检测，结果如图10所示，与正常衰老组相比，元宝枫油干预降低了Enterobacteriaceae、Gluconobacter和M.morganii的相对丰度，表明元宝枫油改善了衰老引起的果蝇肠道菌群结构失衡，因此，元宝枫油的抗衰老作用可能与肠道菌群重塑有关。

图10 Enterobacteriaceae（A）、Gluconobacter（B）和M.morganii（C）的相对丰度分析Fig.10 Analysis of relative abundance of Enterobacteriaceae (A),Gluconobacter (B) and M.morganii (C)

3 讨论

衰老是一种机体结构和功能逐渐下降的过程，并且是心血管疾病、糖尿病、癌症和神经退行性疾病的风险因素[18]。老龄人口剧增已经成为全球性挑战。因此，探索衰老的机制和研发抗衰老的医药保健食品已经成为当前的研究热点和巨大的社会需求。地中海饮食被认为是一种健康的饮食模式，这种饮食的特点是食用丰富的植物性食物和橄榄油作为脂肪的主要来源，脂肪被认为具有潜在抗氧化、抗炎和抗癌作用[19]。地中海饮食可以改变老年人的肠道微生物组，减少虚弱症状，改善健康状况[20]。前期研究表明，元宝枫油的主要成分是长链不饱和脂肪酸和甘油酯[16]。本研究选取品质优良的元宝枫油，探讨其对衰老果蝇生理指标和肠道菌群的影响。寿命是衰老研究中最直观的指标。寿命实验结果表明元宝枫籽油干预能显著延长果蝇的寿命。随着年龄的增加，机体的运动能力会逐渐减弱，运动能力的强弱可以反映衰老的程度[21]。爬行实验的结果表明，衰老果蝇的运动能力明显下降，而元宝枫籽油饲喂能显著改善衰老引起的运动能力下降。认知能力下降是衰老的重要标志。认知衰退可以表现为某些大脑功能的缺陷，包括情景记忆（或陈述性记忆）、空间学习、工作记忆和注意力等[22]。认知能力下降会严重损害老年人的生活质量，增加社会的经济和公共卫生负担[23]。本研究结果表明元宝枫籽油饮食添加显著提高了老年果蝇的嗅觉记忆能力，改善了年龄相关的认知衰退，这可能与其含有的神经酸有关[5]。同时，元宝枫油中含有α-亚麻酸，研究表明，α-亚麻酸可抑制Tau蛋白聚集并调节Tau构象，发挥神经保护作用[24]。衰老机体机能的下降也包括体温调节能力的下降，老年人，特别是65 岁以上的老年人，是环境热暴露期间最脆弱的人群之一，老年人在热暴露期间体温调节和心血管反应受损，这些变化导致老年人在极端热暴露期间的发病率和死亡率显著增加[25-26]。α-亚麻酸膳食摄入降低了心血管疾病的死亡风险[27]。在进行的热刺激实验中，元宝枫籽油干预组的存活率较对照组显著增加，表明元宝枫籽油提高了老年果蝇的热耐受能力。

目前有关衰老机制的假说有许多，其中广为大家接受是自由基理论，后来被称为衰老的氧化应激理论，该理论基于结构损伤的假设，即与年龄相关的功能损失是由于机体新陈代谢过程中产生的活性氧对重要的生物大分子（脂质、DNA和蛋白质）氧化损伤的积累[28]。现在该学说已经成为最有说服力的衰老学说之一。抗氧化酶可及时清除多余的活性氧代谢物，其中机体内最主要的抗氧化酶是SOD、过氧化氢酶（catalase，CAT）和GSH-Px。研究表明，长寿的果蝇体内SOD和谷胱甘肽硫转移酶的活性较高[29]，RNA干扰介导的SOD2沉默缩短了果蝇的平均寿命[30]，过表达MnSOD则可以延长果蝇寿命[31]，RNA干扰介导的SOD1和CAT抑制会导致果蝇寿命急剧缩短[32]。膳食摄入α-亚麻酸后机体可以将其转化为二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA），DHA、EPA可作为Nrf2诱导剂调节机体氧化还原稳态[33]。研究结果表明，与10 日龄年轻果蝇相比，30 日龄老年果蝇体内SOD和GSHPx活力显著下降，与其他学者的研究结果相似[34]。与食用普通培养基的老年果蝇相比，饮食中添加元宝枫油后30 日龄老年果蝇体内SOD和GSH-Px的活性明显升高，这可能是元宝枫油干预组果蝇寿命明显延长的原因之一。

肠道微生物群是一个非常复杂的生物生态系统。大量的研究表明，衰老与肠道菌群组成的变化、炎症和肠道通透性增加有关[35-36]。最近的研究表明，油脂可以调节宿主的免疫反应和肠道微生物群，发挥抗炎作用，有利于宿主健康[37-39]。本实验室最近的研究表明，元宝枫油饮食添加可以降低小鼠体内与免疫密切有关的Th17或Th1淋巴细胞分化，降低促炎细胞因子的表达，调节肠道菌群，促进髓鞘再生[16]。Enterobacteriaceae、Gluconobacter和M.morganii是存在于果蝇肠道中的革兰氏阴性条件致病菌[40-42]。肠道中有些细菌会产生代谢毒物，破坏宿主DNA，影响宿主健康，比如M.morganii[43]。在本研究中，衰老果蝇肠道内Enterobacteriaceae、Gluconobacter和M.morganii的相对丰度增加，而元宝枫油干预后明显抑制了以上3 类细菌在老年果蝇肠道内相对丰度的增加。因此，认为元宝枫油的抗衰老作用可能与调节肠道菌群有关，但具体机制还有待进一步研究。

本实验结果表明元宝枫籽油能延长果蝇寿命，提高果蝇的抗氧化能力、爬行能力、抗热应激能力和嗅觉记忆能力，降低Enterobacteriaceae、Gluconobacter和M.morganii的相对丰度。总之，元宝枫油可改善衰老相关表型，而肠道菌群可能在其中发挥重要作用。本研究为将元宝枫油开发成抗衰老的保健食品和功能性食品提供了实验依据和理论基础。