消栓再造丸中辅料炼蜜的质量考察

陆钫，丁晴

作者单位：无锡市药品安全检验检测中心，江苏 无锡 214028

消栓再造丸（大蜜丸）是由血竭、赤芍、没药（醋炙）、当归、牛膝等39 味中药材制成的大处方成药，具有活血通络、息风开窍，补养气血的功效。炼蜜是由蜂蜜经高温炼制而成，在蜜丸中占比较大，占总量的20%～50%，是蜜丸中重要的辅料［1-3］，在我国中成药生产中使用广泛。近年来，蜂蜜的掺伪、造假现象普遍，主要为掺入蔗糖或者使用人工转化糖浆等替代蜂蜜［4-7］。据报道，人工转化糖浆在转化过程中可产生5-羟甲基糠醛［8-9］。另外，由于蜂蜜制成的炼蜜在工艺上不统一、不规范，会导致炼蜜中有害成分增加，间接影响中药质量，特别是蜂蜜在炼制的过程中，果糖等单糖在高温下会产生5-羟甲基糠醛［10-11］。5-羟甲基糠醛与人体蛋白质结合，对人体横纹肌及内脏有损害，具有神经毒性等危害［12-13］。中国药典对蜂蜜中5-羟甲基糠醛和果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量均制定了限度［14］。也有相关文献报道了蜜丸中5-羟甲基糠醛和糖类成分的限量检查［7，15-18］。

消栓再造丸为2020年国家评价性抽验品种，本次抽检共收集到34 批样品。其现行质量标准较为简单，未涉及对辅料炼蜜的质量考察。因此，2020年5月至2021年12月，本研究拟采用高效液相色谱法（HPLC）建立消栓再造丸中5-羟甲基糠醛的含量测定方法，采用HPLC-蒸发光散射检测器（ELSD）法建立消栓再造丸中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量测定方法，分类别对消栓再造丸中炼蜜的质量情况进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料LC-20AT 高效液相色谱仪（岛津公司）；Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦公司）；电子天平METTLER XSE205（梅特勒公司，精度：十万分之一）；电子天平METTLER XP-19（梅特勒公司，精度：百万分之一）；Milli-Q纯水仪。

5-羟甲基糠醛对照品（批号111626-201912，纯度99.2%），果糖对照品（批号100231～201807，纯度99.6%），D-无水葡萄糖（批号110833～201908，纯度99.8%），蔗糖（批号111507～201704，纯度100.0%），麦芽糖（批号100287～201905，纯度94.4%），均来自中国食品药品检定研究院。

甲醇、乙腈为色谱纯；三乙胺为分析纯；水为纯化水。

1.2 方法

1.2.1 5-羟甲基糠醛测定方法采用LC-20AT 高效液相色谱仪（紫外检测器），色谱柱Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-水（10∶90）为流动相；检测波长为284 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min。

色谱条件考察：考察了不同色谱柱Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phecda C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），结果表明，除保留时间稍有差异外，结果无差异，均能满足分离要求。

对照品溶液制备：取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，置25 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，制成每毫升含291.53 μg 的溶液，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液，分别用水稀释成0.364 4 mg/L、1.457 6 mg/L、3.644 1 mg/L、7.288 2 mg/L、14.576 4 mg/L、29.152 9 mg/L 的溶液，作为系列标准溶液。

供试品溶液制备：取本品水蜜丸研碎，取1 g，精密称定，加水约40 mL，超声处理30 min，放冷，用水定容至50 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.2 糖类成分含量测定方法采用Agilent 1260高效液相色谱仪（ELSD），色谱柱Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；流动相为乙腈-0.2%三乙胺溶液（79∶21）；柱温为35 ℃；流速为0.8 mL/min。ELSD 条件：漂移管温度80 ℃，气体流速2 L/min。

混合对照品溶液的制备：取果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖对照品适量，精密称定，加40%乙腈制成每毫升分别含果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖0.2 mg 的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取本品水蜜丸，研碎，取1 g，精密称定，置50 mL离心管中，精密加入40%乙腈20 mL，称定质量，涡旋1 min，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用40%乙腈补足减失的质量，摇匀，12 cm 离心半径4 000 r/min离心10 min，取上清液，即得。

2 结果

2.1 5-羟甲基糠醛含量测定结果

2.1.1 线性关系考察精密取5-羟甲基糠醛标准对照品系列溶液，按照“1.2.1”色谱条件进样，以对照品浓度X为横坐标，对应浓度的峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程为Y=78 928.77X-2 776.70，R=1，表明5-羟甲基糠醛在0.364 4～29.152 9 mg/L范围内线性关系良好。

2.1.2 精密度试验精密吸取5-羟甲基糠醛标准对照品溶液（S=7.288 2 mg/L），连续进样6 次，测定峰面积，并计算相对标准差（RSD）值为0.04%（n=6），表明精密度良好。

2.1.3 重复性试验取同一批次样品（批号17014041），按“1.2.1”方法平行制备6 份供试品溶液，按照“1.2.1”色谱条件进样。计算5-羟甲基糠醛的含量，并计算RSD值为1.05%（n=6）。表明方法重复性良好。

2.1.4 稳定性试验取同一供试品溶液（批号17014041），分别于0、2、4、8、12、24 h 依次进样，测定峰面积，结果5-羟甲基糠醛峰面积的RSD 值为0.46% （n=6）。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.5 回收率试验取同一批次样品（批号17014041）1 g，精密称定，精密加入5-羟甲基糠醛对照品储备液（S=291.53 mg/L）0.75 mL，按照供试品溶液制备方法，平行制备6 份样品，计算回收率（见表1）。5-羟甲基糠醛的平均回收率为98.31%，RSD 值为1.40%，表明方法准确度符合要求。

表1 5-羟甲基糠醛回收率试验结果（n=6）

2.1.6 检出限和定量限逐级稀释5-羟甲基糠醛对照品溶液，以信噪比10∶1 和3∶1 时5-羟甲基糠醛的浓度测得定量限为0.018 22 mg/L，检出限为0.005 466 mg/L。

2.1.7 样品测定根据建立的测定方法和色谱条件对收集到的34 批消栓再造丸样品进行测定。5-羟甲基糠醛测定结果见表2，色谱图见图1。

图1 消栓再造丸样品色谱图（5-羟甲基糠醛保留时间：10.321 min）

表2 消栓再造丸34批样品中5-羟甲基糠醛的含量测定结果

2.2 糖类成分含量测定结果

2.2.1 糖类成分的回归方程及线性范围精密吸取糖类成分混合对照品溶液1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、30 μL，注入液相色谱仪，按照“1.2.2”色谱条件进样，分别测定峰面积积分值。以对照品进样量的自然对数为横坐标，峰面积积分值的自然对数为纵坐标，进行线性回归，得到回归线方程。见表3。表明线性关系良好。

表3 消栓再造丸糖类成分的回归方程及线性范围

2.2.2 仪器精密度试验精密吸取糖类成分混合对照品溶液10 μL，连续进样6 次，测定各成分的峰面积，并计算其对数RSD 值，结果果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的RSD 值（n=6）分别为0.12%、0.06%、0.09%、0.11%。表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验糖类成分重复性考察见回收率试验，结果表明，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖回收率RSD 值分别为1.79%、1.16%、1.72%、1.17%（n=6）。表明方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验取同一供试品溶液（批号17014041），分别于0、2、4、8、12、24 h 依次进样，测定峰面积，结果果糖、葡萄糖、蔗糖峰面积的RSD 值为1.36%、1.14%、1.33%（n=6）。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.5 回收率试验取同一批次样品（批号17014041）0.5 g，精密称定，分别精密加入果糖100 mg、葡萄糖100 mg，蔗糖10 mg、麦芽糖80 mg，按照“1.2.2”供试品制备方法，平行制备6 份加样供试品溶液，按照“1.2.2”色谱条件进样，依法测定，计算回收率（见表4），结果果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖平均回收率分别为102.77%、97.38%、96.71%、98.36%，表明方法准确度符合要求。

表4 消栓再造丸中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖回收率试验结果（n=6）

2.2.6 检出限和定量限取糖类成分混合对照品溶液进行逐级稀释，以信噪比3∶1时测定检出限，以信噪比10∶1 时测定定量限，结果蔗糖检出限为0.007 928 μg，定量限为0.015 86 μg，麦芽糖检出限为0.016 03 μg，定量限为0.032 07 μg。

2.2.7 样品测定果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖测定结果见表5，HPLC色谱图详见图2，3。

图2 消栓再造丸混合对照品溶液色谱图

图3 消栓再造丸供试品溶液色谱图

表5 消栓再造丸样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量测定结果

3 讨论

3.1 5-羟甲基糠醛限度的拟定《中国药典》2015年版一部蜂蜜项下规定，5-羟甲基糠醛含量不得过0.004%。据文献报道，在炼蜜过程中随着加热温度和时间的增加，5-羟甲基糠醛含量逐步增加。蜂蜜经高温炼制后，5-羟甲基糠醛含量增加10～50 倍，按100 倍折算。制剂按处方中最多加蜜量对制剂中5-羟甲基糠醛含量限度进行折算，拟定消栓再造丸中5-羟甲基糠醛的限度为1.0 mg/g。

3.2 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖限度的拟定《中国药典》2015 年版蜂蜜的标准规定，果糖与葡萄糖之和不得少于60.0%，果糖与葡萄糖含量比值不得少于1.0。因此炼蜜中果糖与葡萄糖含量之和按60%折算，制剂按处方中最少加蜜量，拟定消栓再造丸中果糖和葡萄糖含量应不得少于340 mg/g。

《中国药典》2015 年版蜂蜜的标准规定，蔗糖含量不得过5%，食品安全国家标准GB14963-2011 中规定桉树蜂蜜、柑橘蜂蜜、紫苜蓿蜂蜜、荔枝蜂蜜、野桂花蜜的蔗糖不得过10%，因此炼蜜中蔗糖含量按10%折算，按消栓再造丸处方比例，制剂按最多加蜜量，拟定消栓再造丸中蔗糖含量不得多于60 mg/g。

《中国药典》2015 年版规定蜂蜜中麦芽糖含量不得过5%，炼蜜中麦芽糖含量按5%折算，按消栓再造丸处方比例，制剂按最多加蜜量，拟定消栓再造丸中麦芽糖含量不得多于30 mg/g。

由于果糖、葡萄糖为蜂蜜中必须含有的成分，故规定限度时按蜂蜜最少加入量和含量最低值折算制剂中的量设定限度。而蔗糖和麦芽糖为蜂蜜中不含或少量含有的成分，故规定限度时按蜂蜜的最多加入量、最大限度值来设定限度。

3.3 结论本研究共收集到一个厂家不同批次共计34 批样品。5-羟甲基糠醛含量测定结果表明，34批样品中5-羟甲基糠醛含量在0.124～0.476 mg/g。结果均低于拟定限度值（1.0 mg/g）。且各批次间差异不大，表明质量控制较稳定。糖类成分含量测定结果表明，34 批样品果糖和葡萄糖含量范围381.55～428.61 mg/g，含量均大于限度值（340 mg/g），果葡比均大于1.0。蔗糖含量范围23.23～30.24 mg/g，含量均低于限度值（60 mg/g）。麦芽糖均未检出。糖类成分各项指标均符合规定。表明本次抽验的34批样品中辅料炼蜜质量符合要求。

本研究建立了消栓再造丸中5-羟甲基糠醛和果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量测定分析方法，操作简便快捷，结果准确可靠，为消栓再造丸辅料炼蜜的质量评价提供了科学依据。