重楼皂苷Ⅶ通过p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

朱征全，王松，郭宏志，陈海洋

作者单位：南阳市第一人民医院肝胆胰脾外科，河南 南阳 473000

肝癌是临床最常见的消化系统恶性肿瘤之一，常发于40 岁以上男性人群，以病情进展快、预后不佳为主要特征，可并发自发性低血糖症、肝性脑病、红细胞增多症、肝肾衰竭及其他伴癌重症，危及病人生命安全，现已成为全球第二大癌症相关致死性疾病［1］。临床治疗肝癌以根治性切除术为首选方案，配合放化疗可显著提升早期病人生存率，但对于中晚期病人来说，因其复发率高、转移性强的特点，治疗效果并不理想［2］。重楼是常见中药，具有清热解毒、消肿止痛及凉肝定惊之功效，皂苷是其主要活性成分，主要苷元为薯蓣皂苷元（重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ）及偏诺皂苷元（重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ）。重楼皂苷Ⅶ是判定中药重楼质量的重要指标之一，具有抗菌、抗氧化、免疫调节、止血等多种药理活性。以往研究多集中在重楼皂苷Ⅰ、Ⅵ上，关于重楼皂苷Ⅶ的研究较少。近年来有研究认为，重楼皂苷Ⅶ可显著抑制结直肠癌细胞增殖，诱导细胞周期停滞及细胞凋亡，表现出潜在的抗肿瘤作用［3］。本研究于2021年6 月至2022 年6 月采用重楼皂苷Ⅶ干预肝癌细胞，观察其对该细胞恶性生物学行为的影响，并探讨可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系人肝癌HepG2细胞系，购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物、主要试剂、仪器重楼皂苷Ⅶ（纯度：99%）、p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信号通路抑制剂SB203580（上海易恩化学技术有限公司），噻唑蓝比色法试剂盒、膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）/碘化丙啶（PI）双染凋亡检测试剂盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］，兔抗人p38MAPK、磷酸化p38 丝裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38MAPK）、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK1/2）一抗［艾比玛特医药科技（上海）有限公司］。

Synergy-HT 酶标仪（美国BioTek 公司），SZX16显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.3 细胞培养取HepG2 细胞系在DMEM 高糖培养基（含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素），培养箱内标准条件（37 ℃，5%二氧化碳）下体外培养，每天半量更换培养液，待细胞融合至贴壁，胰酶消化传代，取对数期细胞进行下一步实验。

1.4 噻唑蓝法检测重楼皂苷Ⅶ细胞毒性取对数期HepG2 细胞，缓冲液清洗，胰酶消化、重悬，调整细胞密度为1×105个/毫升接种至96 孔板，待细胞融合至贴壁，分别加入终浓度为（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L）的重楼皂苷Ⅶ DMEM 高糖混合培养液，48 h 后加入新备制噻唑蓝溶液20 μL，2 h 后吸弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO）后摇床振荡至晶体完全溶解，酶标仪测定490 nm 波长处吸光度［D（λ）490nm］，计算各干预孔细胞增殖抑制率（%）=（1-干预孔细胞D（λ）490nm/对照孔细胞D（λ）490nm）×100%，绘制折线图计算重楼皂苷Ⅶ对HepG2 细胞的半抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）。

1.5 干预与分组取对数期HepG2细胞，胰酶消化重悬，待其融合至贴壁，分为对照组、重楼皂苷Ⅶ组、SB203580组、联合组，对照组置于DMEM 高糖培养基常规培养，重楼皂苷Ⅶ组培养基内加入重楼皂苷Ⅶ（终浓度0.8 μmol/L 溶于DMSO），SB203580 组培养基内加入SB203580（终浓度10 μmol/L 溶于DMSO）［4］，联合组培养基内加入重楼皂苷Ⅶ（0.8 μmol/L）、SB203580（10 μmol/L）。干预48 h 用于下一步实验。

1.6 噻唑蓝法检测肝癌细胞增殖能力取干预后各组细胞，清洗、重悬、接种同“1.4”，加入完全培养液常规培养，分别于培养第24、48、72 h 加入新备制噻唑蓝溶液，2 h后吸弃上清，加入DMSO 摇床振荡，酶标仪测定490 nm波长处各组细胞吸光度值。

1.7 Annexin Ⅴ/PI 双染法检测肝癌细胞凋亡率取干预后各组细胞，清洗、重悬，调整细胞密度为1×105个/毫升接种至6孔板，DMEM 高糖培养液常规培养，48 h 后磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗，离心吸弃上清，binding buffer 液重悬并标记细胞，加入AnnexinⅤ-FITC液染色，PI液双染，冷藏避光孵育20 min，经流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.8 划痕实验检测肝癌细胞迁移能力取干预后各组细胞，清洗、重悬，调整细胞密度为1×106个/毫升接种至6孔板，DMEM 高糖培养液常规培养，待贴壁后吸弃培养液，利用移液枪头垂直均匀在板面沿孔中心画出一直线划痕，PBS冲洗掉边缘细胞，无血清培养液继续培养24 h。光镜下拍照测量计算0 h及24 h 划痕面积，计算细胞迁移率=（1-24 h 划痕面积/0 h划痕面积）×100%。

1.9 小室实验检测肝癌细胞侵袭能力人工基膜胶经预冷无血清培养基稀释，以40 微升/孔铺于Transwell 小室底部，取干预后各组细胞，清洗、重悬，调整细胞密度为4×105个/毫升接种于小室中，下层加入完全培养基（含10%胎牛血清），培养24 h 后取出杯底滤膜，PBS 冲洗，甲醇固定，结晶紫染色，PBS 冲洗、风干，置于光镜下观察，选取5 个不相邻视野，拍照记录侵袭细胞数，取均值。

1.10 蛋白质印迹法检测肝癌细胞p38 MAPK、pp38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达取干预后各组细胞，PBS 清洗，加入放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液裂解细胞，注入离心管内，低温离心15 min（10 000 r/min，r=10 cm），弃上清，BCA 法定量蛋白。取40 μg待测样本，按1∶5体积比与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白电泳试剂混匀，金属浴沸腾变性蛋白，电压80 V 行上样电泳分离，跑胶后湿转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，BSA 溶液封闭2 h，加入兔抗人p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2（稀释浓度1∶500），4 ℃冷藏过夜，洗膜后加入二抗（稀释浓度1∶2 000），室温孵育2 h，常规洗膜、发光、显影，经成像分析仪分析各蛋白条带灰度值，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参蛋白，分析p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达水平，计算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2。

1.11 统计学方法数据资料的分析、处理采用统计学软件SPSS 25.0。计量资料以服从正态分布以表示，方差齐，多组间比较采用单因素方差分析，不同时间点样本资料采用重复测量方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各剂量重楼皂苷Ⅶ对肝癌HepG2 细胞的增殖抑制率经终浓度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L）重楼皂苷Ⅶ干预后，其对HepG2 细胞增殖抑制率逐渐升高，IC50位于0.6～0.8 μmol/L，故后续实验采用0.8 μmol/L 作为重楼皂苷Ⅶ干预剂量。详情见图1。

图1 各剂量重楼皂苷Ⅶ对HepG2细胞的增殖抑制率

2.2 各剂量SB203580 对肝癌HepG2 细胞的增殖抑制率经终浓度（1、2.5、5、10、20、40 μmol/L）SB203580干预后，其对HepG2细胞增殖抑制率逐渐升高，IC50位于5～10 μmol/L，故后续实验采用10 μmol/L作为SB203580干预剂量。见图2。

图2 各剂量SB203580对肝癌HepG2细胞的增殖抑制率

2.3 各组细胞增殖能力与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组24、48、72 h 吸光度值降低（P＜0.05），SB203580组24、48、72 h 吸光度值升高（P＜0.05）；与重楼皂苷Ⅶ组比较，联合组24、48、72 h 吸光度值升高（P＜0.05）；与SB203580 组比较，联合组24、48、72 h 吸光度值降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组HepG2细胞吸光度值D（λ）490 nm比较/

表1 各组HepG2细胞吸光度值D（λ）490 nm比较/

注：①与对照组比较，P＜0.05。②与重楼皂苷Ⅶ组比较，P＜0.05。③与SB203580组比较，P＜0.05。

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2.4 各组细胞凋亡率对照组、重楼皂苷Ⅶ组、SB203580 组、联合组细胞凋亡率分别为（3.25±0.78）% 、（39.87±8.94）% 、（1.05±0.15）% 、（11.30±2.80）%（F=72.38，P＜0.001）；与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组凋亡率升高，SB203580 组凋亡率降低（P＜0.05）；联合组凋亡率低于重楼皂苷Ⅶ组，高于SB203580组（P＜0.05）。

2.5 各组细胞迁移能力对照组、重楼皂苷Ⅶ组、SB203580 组、联合组细胞迁移率分别为（74.33±9.37）%、（11.21±3.35）%、（89.30±14.56）%、（40.52±8.18）%（F=64.78，P＜0.001）；与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组迁移率降低（P＜0.05），SB203580 组迁移率升高（P＜0.05）；联合组迁移率高于重楼皂苷Ⅶ组，低于SB203580组（P＜0.05）。

2.6 各组细胞侵袭能力对照组、重楼皂苷Ⅶ组、SB203580 组、联合组侵袭细胞数分别为（364.92±47.99）个、（54.84±7.41）个、（617.04±75.34）个、（141.36±16.75）个（F=152.25，P＜0.001）；与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组侵袭细胞数减少（P＜0.05），SB203580 组侵袭细胞数增加（P＜0.05）；与比较，联合组侵袭细胞数高于重楼皂苷Ⅶ组，低于SB203580组（P＜0.05）。

2.7 各组细胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高（P＜0.05），SB203580 组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 降低（P＜0.05）；与重楼皂苷Ⅶ组比较，联合组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 降低（P＜0.05）；与SB203580组比较，联合组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 升高（P＜0.05）。见表2；图3。

表2 各组HepG2细胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比较/

表2 各组HepG2细胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比较/

注：p-p38 MAPK 为磷酸化p38 丝裂原活化蛋白激酶，p38 MAPK为p38 丝裂原活化蛋白激酶，p-ERK1/2 为磷酸化细胞外信号调节激酶1/2，ERK1/2为细胞外信号调节激酶1/2。①与对照组比较，P＜0.05。②与重楼皂苷Ⅶ组比较，P＜0.05。③与SB203580组比较，P＜0.05。

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图3 蛋白质印迹法检测各组HepG2细胞p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达量

3 讨论

肝癌是源自肝细胞及肝内胆管上皮细胞的原发性癌症，其发病可能与持续性肝损伤有关，乙型肝炎及丙型肝炎病毒感染、饮酒、吸烟、黄曲霉毒素及慢性代谢疾病均与其具有显著相关性，大多数病人依次发展为肝炎、肝纤维化、肝硬化，最终发展为肝癌［5-7］。因早期缺乏特异性症状，超过60%的病人被确诊时已处于晚期，此时肝癌细胞多已出现转移，仅能采用放化疗及免疫靶向药物，但其高恶性的特点，极大缩短了病人生存期［8］。因此临床上亟待开发抑制其高恶性的治疗新药物。中医治疗肝癌由来已久，具有减少放化疗毒副作用、提升机体免疫、多效能、多靶点等多重优势。随着现代提取工艺的进步，从中药中提取单体成分为肝癌治疗带来了新的希望。

本研究结果显示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组24、48、72 h 吸光度值，迁移率降低，凋亡率升高，侵袭细胞数减少，提示重楼皂苷Ⅶ可抑制肝癌HepG2 细胞增殖、迁移及侵袭，并诱导凋亡。中医将肝癌归属于“肝积”“黄疸”“肝水”等症范畴，主要病机为机体失和、病邪乱入，脏腑失调、气血不通，或情志内伤、宣发无门、肝气郁结，横逆犯脾、水不克化、日久生痰、痰瘀互搏、肿块积聚、发为肝积，故治疗应以清肝去火、化瘀排毒为主［9-10］。重楼是中医治肝常用中草药，入肝经血分，可化瘀、凉肝、解毒、清热，重楼皂苷Ⅶ是自其提取的一种甾体皂苷化合物，可通过增加线粒体分裂及活性氧产生，降低线粒体膜电位，从而产生细胞毒性诱导卵巢癌凋亡［11-12］。何昊等［13］进行了一项关于重楼皂苷Ⅶ对胰腺癌细胞影响的研究，结果发现其可抑制胰腺癌PANC-1 细胞增殖、迁移和侵袭，并可能通过下调PD-L1 表达诱导PANC-1 细胞凋亡。此外，Zhang等［14］研究认为，重楼皂苷Ⅶ可显著抑制斑马鱼肿瘤异种移植癌细胞及肝癌荷瘤小鼠肺转移，改善转移引发的肺损伤，降低体外HepG2 细胞血管生成和转移能力，提示其可作为治疗肝癌的潜在候选药物。

p38 MAPK 信号通路是一条重要的肿瘤相关通路，是MAPK 通路家族成员，在恶性肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、自噬等过程中扮演重要角色［15］。p38 MAPK、ERK1/2是该通路重要调控因子，二者均属于丝蛋白/苏氨酸激酶家族，外界交换因子激活通路上游丝/苏氨酸蛋白激酶引发MAPK 三级连接反应（MAPKKK-MAPKK-MAPK），p-p38 MAPK 中酪氨酸及苏氨酸使之激活，进一步磷酸化下游唯一底物蛋白ERK1/2，ERK1/2 进入细胞核后调节多个转录因子活性，参与细胞能量、死亡抵抗、免疫逃逸、骨架结构改变及细胞能动性调控，从而发挥其抑癌功效［16，14］。Han 等［17］体外实验表明，激活p38 MAPK 通路可抑制人肝细胞癌细胞生长，诱导细胞凋亡及G2/M 期阻滞，从而对肝细胞癌荷瘤小时产生治疗作用，提示p38 MAPK 通路或可成为肝癌新治疗靶点，提升其通路活性可作为肝癌治疗未来研究方向之一。Zhang 等［18］在脂多糖刺激的RAW264.7 细胞和多种动物模型中对重楼皂苷Ⅶ的抗炎活性及其潜在机制进行了研究，结果发现，重楼皂苷Ⅶ在多种体外和体内模型中均具有很强的抗炎活性，通过下调MAPK 和核因子-κB（NF-κB）通路发挥抗炎作用，可能是其治疗癌症的机制之一。本研究结果显示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 升高，在重楼皂苷Ⅶ基础上增用p38 MAPK 通路抑制剂SB203580 可减弱重楼皂苷Ⅶ对肝癌的治疗作用，提示重楼皂苷Ⅶ可能通过激活该通路治疗肝癌。

综上所述，重楼皂苷Ⅶ可抑制肝癌HepG2 细胞增殖、迁移及侵袭等恶性生物学行为，并诱导其凋亡，作用机制可能与激活p38 MAPK信号通路相关。