基于网络药理学及分子对接技术探讨金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退的作用机制

何佳宁，赵伟博，王佩娟

作者单位：1南京中医药大学研究生院，江苏 南京 210023；2无锡市中医医院妇产科，江苏 无锡 214000；3江苏省中西医结合医院妇产科，江苏 南京 210028

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是女性常见的妇科内分泌疾病，病人多有月经失调，同时伴有痤疮、多毛、脱发、肥胖等临床症状，国内育龄期女性PCOS 发病率为6%～10%，其中不孕者达30%～60%，严重影响着女性的生理心理健康及家庭幸福［1-2］。甲状腺功能减退（简称“甲减”）也是常见的内分泌系统疾病，病人以乏力、情绪低落、皮肤干燥、水肿、记忆力下降等临床表现为主，目前我国甲减发病率约为1.1%，而亚临床甲减病人高达16.7%［3］。目前已有相关研究表明PCOS 与甲减的发生有一定的关联性，且长期发展皆易引起高血压、冠心病等疾病的发生［4-5］。

金匮肾气丸出自医圣张仲景《伤寒杂病论》杂病病篇，擅温肾益精，专治肾精、肾阳亏虚之虚劳、痰饮之病，其组方脾肾同调，益精填髓，补中寓泻，阴中求阳。祖国医学并无PCOS、甲减等病名，根据其临床表现PCOS 可归属于“月经稀发”“不孕”范畴，甲减归属于“虚劳”“瘿病”范畴。中医认为“足少阴肾经起于足小趾端下……其直者：从肾，上贯肝、膈，入肺中，循喉咙”“任脉起于胞中……沿胸腹正中直上至咽喉”“冲脉起于胞中……一支挟脐上行，与足少阴经相并，散布于胸中，再向上行，经咽喉”，认为胞宫、肾及甲状腺通过经络的络属相互联系沟通，所以认为PCOS、甲减的发生多与肾相关。同时“肾者主蛰，封藏之本，精之处也”，肾精，主人体生长发育及生殖，同时也是机体的原动力；肾阴肾阳为一身阴阳之根本，又如《景岳全书·命门叙》中所云：“命门为精血之海……五脏之阴气，非此不能滋；五脏之阳气，非此不能发”。所以在病理状态下，肾精不足则经水化源不足，影响天癸泌至；肾气不得充养，则命门相火无以生发元气，进而影响生长发育出现呆小、善忘等。若肾阳气不足则温煦推动失职，脾阳失于肾阳温煦易形成痰湿，进而导致困倦、乏力、肥胖、水肿等，同时胞宫气血受寒凝，瘀血阻滞，经脉不通，月经不能按时下泄。所以肾精亏虚、肾阳不足多易导致PCOS、甲减的发生，治疗上以益肾填精，温补肾阳为基本大法，这也就符合中医上“异病同治”的理念，即对于不同的疾病若病因、病机相同时则可采取相同的治法。

网络药理学是基于“疾病、基因、靶点、药物”相互作用网络的基础上，通过网络分析，系统综合地探讨药物治疗疾病的相关机制，虽然现代药理研究及临床试验证实，金匮肾气丸在治疗内分泌相关疾病方面有确切的疗效［6-9］，但研究多针对单一疾病展开，所以本研究自2022 年3—10 月从“异病同治”角度入手，结合网络药理学方法，探讨药物的作用机制，以期为临床用药提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 金匮肾气丸活性成分及靶点的获取通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）以熟地黄、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮、桂枝、附子为关键词进行检索，再利用口服生物利用度≥30%以及类药性≥0.18 进一步筛选，获取各药中的潜在活性成分。同时通过TCMSP数据库收集其蛋白靶点，借助UniProt数据库筛选与人相关蛋白靶点对其名称进行规范。

1.2 疾病靶点的获取通过The Human Gene Database（GeneCards）数据库（https：//www.genecards.org/）以及DRUGBANK 数据库（https：//go.drugbank.com/）检索与PCOS、甲减相关的靶点，通过微生信在线工具（http：//www.bioinformatics.com.cn）绘制药物和疾病靶点的韦恩图并取交集。

1.3 金匮肾气丸治疗PCOS、甲减“药物-成分-靶点”网络的构建将药物靶点分别与PCOS 疾病靶点、甲减疾病靶点取交集，再将分别得到的交集靶点进行匹配获得金匮肾气丸干预两种疾病的共有靶点，导入Cytoscape 3.7.1构建“药物-成分-靶点”网络。

1.4 金匮肾气丸治疗PCOS、甲减蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建将共有靶点输入STRING 11.5 数据库（https：//string-db.org/），生物种类“homo sapiens”，置信度“medium confidence（0.4）”，得到的数据导入Cytoscape构建PPI网络。

1.5 核心靶点筛选基因本体（GO）和京都基因和基因组数据库（KEGG）富集分析利用R 包cluster-Profiler，org.HS.eg.db，enrichplot 包将基因Ensemble转化为ID 形式，并对基因进行GO 和KEGG 分析，通过ggplot2 包对结果进行可视化。以P＜0.05 作为富集筛选条件。

1.6 分子对接对度（Degree）值排名前5的药物分子和前20 的蛋白分子进行分子对接分析。通过Pubchem 网站下载金匮肾气丸药物活性成分并保存为mol2 文件格式；Chem3D 19.0 对获得的药物化合物进行能量最小化。PDB 数据库中搜索靶点蛋白PDB ID，保留2D SDF 文件。通过SYBYL-X 2.0 软件计算对接亲和力的总分。亲和力总分高于7.0 被认为是高亲和力表现，并对结果进行可视化。

2 结果

2.1 金匮肾气丸活性成分及预测靶点通过检索TCMSP数据库筛选收集到金匮肾气丸中8味中药所含的活性化学成分共102 个，其中熟地黄2 个、山药16 个、山茱萸20 个、茯苓15 个、泽泻10 个、牡丹皮11个、桂枝7个、附子21个，去除重复值后共有92个活性成分，见表1。经UniProt 数据库标准化注释并去重后得到196个基因靶点。

2.2 疾病靶点及共有靶点的预测以“Polycystic Ovary Syndrome、Hypothyroidism”为检索词利用DRUGBANK 进行检索分别获得疾病靶点38、55 个，利用GeneCards（以relevance score，即前50%进行筛选）分别获得靶点2 510、2 455个。将药物成分靶点分别与2 种疾病靶点进行匹配，最终得到金匮肾气丸与PCOS交集靶点101个，金匮肾气丸与甲减交集靶点82个，三者共有靶点65个，通过Venn图可视化展示，见图1。

图1 金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退药物疾病靶点交集图

2.3 “药物-疾病-靶点”网络的构建将金匮肾气丸相关靶点信息导入Cytoscape 软件构建“药物-疾病-靶点”网络，见图2。分析结果显示，网络图有114个节点，224 条边、平均节点度值为15.57。根据度值的大小由高到低进行排序，列出度值排名前5 名的药物，见表2。为槲皮素、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇，其度值分别为63、23、18、14、9。

图2 金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退“药物-疾病-靶点”网络图

表2 金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退度值排名前5的活性成分

2.4 PPI 网络的构建将三者共有靶点通过STRING 数据库构建PPI 网络，再导入Cytoscape 软件进行可视化分析，见图3。结果显示，网络图有65个节点，918 条边，平均节电度值为28.25。根据度值大小由高到低进行排序，度值排名前20名的靶点有VEGFA、IL-6、TNF-α、Akt1、CASP-3、TP53、MMP-9、IL-1B、EGF、PPARG、CCL2、EGFR、ESR1、MYC、NOS3、IL-10、SERPINE1、PTEN、IFNG、HMOX1。这20 个靶蛋白是PPI 网络核心节点，很可能是金匮肾气丸干预PCOS及甲减的关键靶蛋白，见表3。

图3 金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退药物疾病靶点交集图

表3 金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退核心靶点蛋白信息

2.5 GO 与KEGG 富集生物分析将65 个共有靶点利用R语言进行GO富集分析得到生物过程2 126个，其中包括对激素的反应、腺体发育、蛋白质磷酸化的正调节等；分子功能120个，其中包括细胞因子受体结合、核受体活性等；细胞组成40个，其中包括膜筏、囊泡腔、内质网腔等。根据-lgP值，对富集结果前20 条进行可视化处理，见图4A～4C。在KEGG富集分析结果中显示筛选得到153 条信号通路，其中包括PI3K-Akt 信号通路、AGE-RAGE 信号通路、胰岛素抵抗、JAK-STAT 信号通路等，根据每条通路的P值将排名前20 位的进行可视化处理，见图4D。同时分别研究金匮肾气丸治疗PCOS 与甲减的单独作用通路，结果见表4。“异病同治”的关键通路富集到的基因，结果见表5。

图4 金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退富集生物分析信息：A为生物过程基因本体（GO）结果；B为细胞组成GO结果；C为分子功能GO结果；D为京都基因和基因组数据库（KEGG）结果

表4 金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退靶点的KEGG分析

表5 金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退关键通路的富集基因

2.6 分子对接选取核心靶点VEGFA、IL-6、TNFα、Akt1、CASP-3、TP53、MMP-9、IL-1B、EGF、PPARG与化合物分子槲皮素、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇进行分子对接，结果见表6。通常情况下，配体与受体之间的结合能越低，二者之间越有可能发生作用，结合能＜-20.929 3 kJ/mol 表示化合物与蛋白结合较好。分子对接结果显示，IL-6 与β-谷甾醇结合效果最好，IFNG 与β-谷甾醇结合效果次之，IFNG与豆甾醇结合效果较好。关键化合物与核心靶蛋白分子对接模式图，见图5。

图5 金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退关键化合物与核心靶蛋白分子对接模式图

表6 金匮肾气丸“异病同治”多囊卵巢综合征和甲状腺功能减退关键化合物与核心靶蛋白分子对接表

3 讨论

近年来PCOS、甲减的发病率逐年上升，其均有病程迁延、反复发作，且远期并发症多的发病特点，不仅影响病人身体健康，而且也加重了家庭及社会的负担。现代医学多通过替代疗法等维持人体内分泌水平稳定或调整月经周期，但长期使用存在一定的依赖性及并发症。通过中医辨证论治的理论，认为两者在病因病机上均与肾精亏虚、肾阳不足有关，且金匮肾气丸是中医经典名方，全方诸药合用共奏补肾益精、阴中求阳的功效。所以本研究基于“异病同治”理论，结合网络药理学方法，从金匮肾气丸治疗PCOS、甲减的有效成分及共同靶点出发，初步探讨其发挥作用的机制。

研究通过网络药理学方法筛选得到金匮肾气丸有效活性成分92 种，其中靶点较多的有槲皮素、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇，其中槲皮素是一种在植物中广泛存在的黄酮类化合物，其具有抗氧化、抗炎、免疫调节等多种药理活性［10-12］，王针织［13］研究发现槲皮素可以增加PCOS 模型大鼠正常卵泡及黄体的数量，同时改善卵巢局部微环境以达到治疗PCOS 的作用，槲皮素也可以上调小鼠血浆3，5，3′-三碘甲腺原氨酸（T3）及甲状腺素（T4）水平，并下调促甲状腺素水平。山柰酚有抗氧化、抗炎、抑制脂肪生成［14］和促进胰腺β 细胞［15］的作用。研究发现，其可以通过介导胰岛素受体底物-1（IRS-1）、IkB激酶α（IKKα）和IkB 激酶β（IKKβ）的磷酸化，来改善胰岛素抵抗导致的胰岛素信号缺陷［16］。β-谷甾醇主要发挥抗炎、抗氧化、降脂、调节免疫、抗衰老等作用。研究发现β-谷甾醇可能通过PI3K/Akt 信号通路来调节颗粒细胞增殖，抑制凋亡，进而促进雌激素的分泌［17］，β-谷甾醇、豆甾醇作为甾醇成分也可通过与胆固醇竞争结合位点［18］，也可以减少胆固醇、脂质的吸收与再吸收［19］，减少代谢综合征的发生，豆甾醇也同时具有抗分解代谢特性，能够改善甲减病人脂代谢等功能。

PPI 网络分析显示金匮肾气丸通过复杂网络调控疾病，其中IL-6 是一种常见的炎症因子，与人类的生殖生理密切相关，Salvi 等［20］证实，甲状腺细胞表面含有IL-6 受体（IL-6R），研究发现IL-6、白细胞介素-8（IL-8）等可能参与亚临床甲减的病理生理过程［21］，同时在PCOS 病人颗粒细胞中IL-6 的表达也会明显升高［22］。TNF-α 也是一种炎症介质，在原发性甲减病人外周血中TNF-α 表达明显升高，且与疾病严重程度有关［23］，研究也发现在PCOS病人TNF-α基因rs4645843位点CC 基因型和C等位基因频率明显上升［24］，同时在大鼠模型中也发现血清TNF-α 水平和血清睾酮水平呈正相关。MMP-9 是MMP 家族的一员，可以通过降解、重塑细胞内外基质中的多种成分，研究发现PCOS 病人血清中MMP-9 水平与雄激素、黄体生成素呈正相关，这多与卵巢皮质分解增多有关；同时也发现MMP-9 通过破坏基底膜、促进新生血管生成等，致卵巢、甲状腺肿瘤浸润及发生腺外侵犯。EGF 是表皮生长因子家族成员，在甲状腺滤泡表皮细胞中有所分布，不仅介导调节甲状腺组织增殖，也影响着胚泡着床，研究还发现PCOS 病人血HB-EGF 表达水平高于卵巢囊肿组［25］。PPARG 是一种重要的代谢性核受体转录因子，参与并调控脂肪细胞分化和脂代谢，研究发现甲减病人脂质代谢障碍会更严重，同时通过临床研究发现PCOS 病人中肥胖或超重的比例明显增加，且PPARG 基因rs3856806 位点在相加模型条件下与PCOS的发生有关联［26］。

KEGG 通路分析结果得知，金匮肾气丸对机体多条信号通路都具有调控作用。其中AGE-RAGE信号通路参与氧化应激和炎症反应，研究发现PCOS妇女的血清AGEs水平明显高于非PCOS，AGEs也而会干扰各种细胞的胰岛素受体信号通路［27］，诱导胰岛素抵抗的发生，同时也有研究显示胰岛素抵抗会进一步导致甲状腺组织增生［28］。PI3K-Akt 信号通路参与细胞的生长发育、葡萄糖转运等过程，控制各种癌症发生与进展，其中甲状腺滤泡上皮细胞的存活率的与甲减的发生密切相关，康春嵋等［29］研究发现艾灸通过激活PI3K-Akt 通路，改善甲状腺滤泡上皮细胞的凋亡，从而对甲减起到了治疗作用，同时下丘脑PI3K 异常是PCOS 病人胰岛素抵抗及排卵减少的重要机制，沈凌宇等［30］研究发现针灸通过调节下丘脑PI3K通路来改善局部微炎症，从而对PCOS 合并胰岛素抵抗大鼠起到治疗作用。JAKSTAT信号通路是细胞生长、分化和凋亡等一系列生理反应的关键环节，研究发现在甲状腺癌及卵巢癌中均有STAT3、STAT5 持续性激活诱导的相应蛋白高表达［31-32］。PPAR 信号通路主要涉及血脂、血糖的代谢，其中以PPAR-α 分布最为广泛［33］，通过调节脂蛋白的水平、介导细胞内胆固醇的代谢等过程来促进脂质代谢，从而减少代谢综合征的发生。

综上所述，金匮肾气丸通过抑制炎症反应、调控细胞凋亡、胰岛素抵抗等多靶点、多途径发挥“异病同治”的作用，对既往文献整理发现金匮肾气丸治疗PCOS、甲减的疗效确切，相关机制研究结果与本次网络药理学预测结果相似，进一步说明了预测的可靠性，为后续实验研究提供思路和依据。

（本文图1～3见插图3-1，图4，5见插图3-2）