急性心肌梗死中环状RNA CDR1as位点筛选的研究

唐赛赛，孙秀梅，王海凤，许梦婷，林 浩，李文勇

（1.山东中医药高等专科学校，山东 烟台 264199；2.滨州医学院烟台附属医院检验科，山东 烟台 264100；3.滨州医学院烟台附属医院肿瘤科，山东 烟台 264100）

心肌梗死（myocardial infarct，MI）发病率逐年升高，且呈年轻化趋势。近年来，一些个体中已有明显的家族遗传表现，提示遗传因素在诱发MI过程发挥重要作用，而基因多态性是决定这种遗传性的重要因素。因此，进行单核苷酸多态性（SNP）对比研究，可确定SNP位点与疾病发生风险关系[1-2]。位于X染色体q27.1的小脑变性相关蛋白1反义转录物（CDR1as）也叫LINC00632。其作为miRNA-7海绵，通过抑制miRNA-7a活性而上调其靶基因聚ADP核糖聚合酶（PARP）和特异性蛋白1（SP1）[3]的表达，促进MI进程[4]。Shao等[5]研究发现CDR1as在糖尿病心肌病中促进心肌细胞凋亡；Zhang等[6]研究发现MI患者外周血CDR1as表达水平明显升高，这均提示CDR1as可作为心脏损伤辅助诊断的依据。因此，本研究对CDR1as基因中国汉族人群最小等位基因频率（MAF）＞20%的SNPs位点（rs12688274、rs5907638、rs76284232）进行分型，筛选出影响MI发生风险的SNPs位点，现报道如下。

1 资料与方法

①获取基因在染色体上的位置信息。打开http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index，输入基因 LINC00632，点击“Go”进入LINC00632基因信息界面，出现染色体上的位置为X:139,791,932-139,854,844。②VCF to PED Converter界面操作步骤。点击“Tools”按钮找到左侧“VCF to PED Converter”打开并点击“VCF to PED Converter”将CDR1as在染色体上的位置信息和Choose data collections or provide your own file URLs选择Phase 3。Select one or more phase 3 populations选择中国汉族北京人群（CHB），Base format选择Numbers。勾选biallelic only，其他参数默认，点击run，如图1所示。③等待刷新完毕，显示done，点击查看结果。下载ped和info文件，info文件存储SNP的编号、位置信息，ped下载后将该文件解压缩后与info文件放在同目录下。④在Haploview里，默认第一种输入格式linkage format，Data File点击Browser选择之前保存的ped文件，info文件自动识别（也可“Browser”手动选择info文件，其他参数不变，点击“OK”导入数据）。进入check marker界面，将根据哈代-温伯格平衡定律的cut off值设为0.05，MAF设为0.2。其他参数默认，点击“rescore markers”自动筛选符合条件的SNP，在表格区域显示在check markers筛选的SNPs。设置筛选条件，默认r2阈值为0.8，r2＞0.8说明两个位点高度连锁，其他参数可不调整。确认参数后，点击run tagger，弹出筛选结果，得到15组（其中10个没有和其他SNPs高度连锁）。最后，根据位点在基因上的位置和MAF大于20%选出合适的位点进行分析。

图1

2 结果

2.1 CDR1as染色体位置在千人基因组中查找到CDR1as在染色体的位置为X: 139,791,932-139,854,844，用于VCF to PED Converter。

2.2 CDR1as中其他高度连锁的染色体位置编号通过Haploview软件得到CDR1as中其他高度连锁的染色体位置编号，见表1。

表1 CDR1as中其他高度连锁的染色体位置编号（MAF＞20%）

2.3 CDR1as中没有高度连锁的染色体位置CDR1as中其他没有捕获的染色体位置为X:139796996，X:139854816，X:139812042，X:139826741，X:139853006，X:139797629，X:139793630，X:139803812，X:139845866，X:139844407。

2.4 CDR1as的基因多态性结合NCBI上SNP位点在染色体的位置，挑选位于外显子区域并且有转录本的SNPs，见表2。

表2 CDR1as的基因多态性

3 讨论

MI常见以冠状动脉粥样硬化为基础疾病的患者，在各种因素诱导下冠状动脉斑块破裂，心肌进而急性缺血、缺氧，持续一段时间后引起心肌缺血性坏死。MI主要症状为持久且严重的心绞痛，常伴心律失常、低血压、心力衰竭甚至休克，好发于老年人群。随着人口老龄化加剧，MI发病率呈上升趋势且逐渐年轻化，严重威胁生命安全，因此尽早识别、诊断对保护心肌正常细胞及改善患者预后十分关键。MI病因和发病机制复杂，其危险因素包括遗传、抽烟、喝酒、年龄、性别等[7]。目前认为MI是多基因参与、遗传和环境因素共同作用的结果，遗传因素不仅与MI发病相关，还影响MI进展与预后情况。遗传变异的主要物质就是基因，基因在结构上分为编码区和非编码区两部分。真核生物的编码区是不连续的，分为外显子和内含子，转录过程中会修剪内含子，拼合外显子形成转录产物。外显子区域占整个人类基因组1%左右，却包含85%左右的已知疾病的变异基因。相比全基因组测序，外显子测序成本低，且可检测到全基因组测序无法鉴定的SNP位点。最常见的遗传变异是SNP，当排除其他混杂因素时，一个遗传标记在病例组中出现的频率明显高于正常对照组，说明其与该疾病具有关联性。

1976年，环状RNA（circRNA）首次从RNA病毒中被检测出来[8]，被认为是线性RNA剪接错误的产物[9]。但近年来，高通量测序技术被广泛应用，研究发现很多人类疾病的发生发展与circRNA有关，circRNAs在心血管疾病发生和发展中的分子机制被探讨和验证[10-13]，如circRNAs分子在人类、老鼠心脏内广泛表达，并可作为微型核糖核酸或相关蛋白的海绵分子，参与心血管疾病的调节过程[14]。且circRNA与线性RNA不同，其不具有5'端帽子和3'端尾结构，呈共价闭合环状结构，不易受RNA外切酶降解，因此可在组织或体液中稳定存在。这提示circRNA具有成为心血管疾病的分子诊断标志物的潜力[15-16]。也有研究表明circRNA基因的多态性可影响自身的空间结构，改变circRNA的表达及其调控的信号通路，进而影响个体对心肌梗死的易感性[17]。Geng等[4]研究发现circRNA中的CDR1as参与MI的过程，发挥针对miR-7的“分子海绵”生物功能，与miR-7结合后miR-7活性受到负向调控，使miR-7对miR-7靶基因PARP和SP1的抑制作用下降，从而上调靶基因表达促进心肌细胞凋亡。MI发生后会引起心肌细胞凋亡、纤维化重塑等变化，严重影响心脏功能[18]。所以适当减少心肌细胞凋亡对治疗MI非常重要。

综述所述，针对MI的研究中CDR1as可能作为一个新型潜在靶点，本文在CDR1as众多个SNPs位点筛选出位于外显子区域且有转录本的3个检测位点分别为rs12688274、rs5907638、rs76284232，证明通过PubMed、千人基因组计划和Haploview联用可实现标签SNPs筛选，值得进一步探索。这可能为后续研究CDR1as与MI的相关性节省大量人力物力，也可能为其他基因筛选SNP提供新的方法。