用新型间充质干细胞制剂治疗猫创口延迟愈合

李巴仑,吕长荣,颜小云,赵献军,华进联*

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西省干细胞工程技术研究中心,陕西杨凌 712100;2.百欧派(天津)生物技术有限公司,天津 300350;3.西安家佳动物医院,陕西西安 710000)

伤口延迟愈合的原因有感染、药物、异物存留、损伤严重、营养不良、疾病、年龄因素、皮肤缺损、自体敏感、脂肪液化、皮下积液等[1-2]。常见的处理办法包括抑制炎症、清除异物和失活组织,彻底止血,冲洗伤口及再缝合[3]。但由于创伤形成的复杂性,临床上常出现伤口难以愈合的现象。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有自我更新、多向分化潜能的细胞类群[4]。MSCs具有低免疫原性、多来源途径、多分化潜能及强大的旁分泌功能等特征,能够在机体中通过全身性功能调节以恢复机体内环境稳态[4]。已有多项研究针对MSCs在疾病中的治疗作用进行了试验探究,包括治疗心肌梗塞、自身免疫性疾病、糖尿病、肝损伤及肾脏损伤等[4-8]。MSCs治疗涉及到多种途径,包括抗炎、抗氧化应激、抗内质网应激、激活免疫系统及促进受损部位再生等[4]。

MSCs的应用方法包括静脉输注、局部注射等方式。MSCs治疗一个疗程通常需要多次输注,每次间隔一定时间,一个疗程约为1～2个月。且MSCs分次输注操作繁琐,需每次输注前进行MSCs的复苏传代及扩增,单个流程通常需要3～5 d,一般需要3～5次。MSCs的保存、培养条件及操作人员的变化也影响着MSCs治疗的效果。将MSCs疗法用于宠物临床中某些发病急、病程快的疾病的最大障碍包括MSCs准备时间长,操作要求高、保存时间短等。

MSCs受限于操作时间和操作平台无法大规模应用于疾病治疗。已有部分研究集中于MSCs的储存温度和环境。中短途运输(≤60 h)中4℃保存的MSCs比在25℃和37℃具备更强的细胞活力[9]。在MSCs制剂中加入50 mL/L人血清白蛋白提高了MSCs的冻存效率[10]。在0.9%生理盐水基础上增加脯氨酸作为保护剂以增强MSCs短途运输效率[11]。在MSCs中短途运输(≤60 h)中常使用0.9%生理盐水、磷酸盐缓冲溶液、林格溶液等作为溶媒,但上述方案仍不能满足大规模制备和长期保存MSCs以用于临床疾病治疗。本文用甜菜碱和海藻糖作为细胞制剂的主要冷冻保存组分。在MSCs制剂中添加褪黑素,米托蒽醌甲磺酸盐及胶原蛋白以促进MSCs的存活和疗效[4,12]。

本病例由于创口反复感染化脓,上述办法尝试2个月后仍无法治愈。为了促进该病例的良好预后,将间充质干细胞与多种小分子组合,治疗猫的创伤延迟愈合。本文描述了一种新型直接使用的MSCs剂型,以保证MSCs治疗的时效性和便携性,并完全治愈了猫延迟愈合的旧创,显示了干细胞治疗的强大优势的旧创,显示了干细胞治疗的强大优势。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 猫脂肪间充质干细胞(MSCs)由陕西省干细胞工程技术研究中心分离扩增[4,8]。

1.1.2 主要试剂 α-MEM培养基、Tryple Express,Gibco公司产品;MSC Serum-free Basal Medium,创凌生物公司产品;无水甜菜碱、D-海藻糖,优索生物公司产品;褪黑素、MitoQ、一型胶原蛋白均,索莱宝公司产品;卡波姆-940,源叶生物公司产品;甘油、氢氧化钠、Tween-80、尼珀金乙酯钠盐、三乙醇胺,均为梯希爱公司产品。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱,美国赛默飞公司产品;超净工作台,北京亚泰科隆公司产品;倒置显微镜,日本尼康公司产品;冷冻干燥机,顺治公司产品;-80℃冰箱,海尔公司产品;全自动血常规分析仪,美国Bio Tec公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病例概况 2022年10月西安家佳宠物医院接诊1例雌性加菲猫膀胱结石,进行开腹手术取出结石。术后2月创口无法愈合,伤口四周红肿。经兽医师诊断,血清淀粉样蛋白A显示4 mg/L(正常范围:<10 mg/L)及血常规数据显示正常(表1),按5 mg/kg头孢克肟联合甲硝唑20 mL静脉注射连续用药2月未见好转。该病例伤口延迟愈合可能与前期手术、年龄、自体敏感等因素相关,导致伤口处皮肤再生能力减弱。

表1 血常规检查

1.2.2 间充质干细胞扩增 MSCs经37℃水浴复苏后经1 000 r/min离心3 min,去除上清液后加入含10% FBS的α-MEM重悬,接种于100 mm培养皿中。MSCs在5%CO2培养箱中37℃培养[12]。待MSCs增殖至80%～90%时,弃去培养液。用PBS洗去残余培养液后,加入0.25%胰酶,37℃消化3～5 min,加入与胰酶等量培养液终止消化,转入离心管中1 100 r/min离心3 min。弃去上清后加入新α-MEM重悬,转入100 mm培养皿中继续培养。待细胞长至80%～90%时,用上述消化方式消化MSCs。

1.2.3 间充质干细胞制剂制备 将1.2.2得到的MSCs用含10% FBS的α-MEM重悬,加入80 μg无水甜菜碱,20 μg D-海藻糖充分混匀。加入10-6mmol/L 褪黑素,10-6mmol/L MitoQ及10 μg胶原蛋白,重悬混匀后加入细胞冷冻保存管,置于-80℃保存。

1.2.4 治疗方法及预后 经医师或在医师指导下清理创面,使创口环境有利于愈合。将干细胞制剂自冰箱取出,水浴或手持解冻使其恢复至室温;使用注射器对细胞制剂反复吹打混匀,使细胞制剂不可见絮状物质;将细胞制剂于伤口四周皮下注射,注射位置应尽量均匀分布在创口周围。MSCs制剂每2 d注射1次,连用1周,持续监测患宠损伤部位恢复情况。用ImajeJ软件对伤口表面进行定量分析。

2 结果

该病例手术创口经两月余无法愈合,皮肤伤口处红肿,持续感染化脓,多次清创再缝合均无法治愈(图1)。经MSCs治疗第0天,组织坏死,溃烂,充血伤口渗出血液及纤维蛋白原。清创后局部注射MSCs制剂。第1天及第2天创口逐渐收缩,长出肉芽组织。治疗第3天至第5天创口收缩,愈合速度加快,创口范围逐渐缩小,由4 cm逐渐缩小至2.5 cm。第5天至第18天伤口表皮组织增生,创口收缩,化脓及红肿等不利症状消失。第21天至第33天创口完全愈合,并长出毛发(图2)。对创口表面信息进行定量分析(图3)。

图1 患宠治疗前创口信息

图2 间充质干细胞制剂治疗促进猫创伤延迟愈合

A.用干细胞治疗第0天至第33天伤口愈合率定量分析; B.自发病起伤口愈合率定量分析

3 讨论

大多数创伤可在1～2周完成愈合过程[2]。但在临床治疗中,感染、衰老、药物、复杂的创伤环境,如营养缺乏或其他疾病导致的慢性创伤等引起伤口难以愈合。在宠物临床诊疗中,由于原发病的复杂性、宠物品质和相关诊断手段的局限性,常出现创口难以在常规时间内愈合现象[13]。

近年来,针对干细胞治疗各种宠物疾病已取得多项突破性进展,包括犬猫糖尿病、肝损伤、肾损伤及皮肤损伤等[4-6,8,12,14]。目前,MSCs的主要治疗机制包括旁分泌细胞因子、外泌体、定向趋化能力及体内分化等。但MSCs疗法局限于极短的保存时间、繁琐的操作步骤及较高的操作要求,在宠物治疗应用中往往不能及时发挥治疗作用。褪黑素、MitoQ、胶原蛋白等可有效促进MSCs的体外活力[4]。本研究集合了多种促进MSCs活力的小分子,并改良MSCs的保存条件,制备了快速、便捷、作用效力强的新型MSCs制剂,对1例临床猫创口延迟愈合进行治疗。证明MSCs制剂治疗效果较好。通过促进皮肤组织愈合,改善机体微环境,使预后不良的创口加速愈合过程。本病例用为未来MSCs临床化提供了一种切实可行的治疗策略。