新流腺三联灭活疫苗对禽流感病毒和禽腺病毒流行株攻毒的免疫保护试验

杨灵芝,李本科,朱 杰,李振清,李桂芹

(1.山东博莱威生物技术研究所,山东滨州 256606;2.山东滨州沃华生物工程有限公司,山东滨州 256606;3.滨州市农业技术推广中心,山东滨州 256600; 4.滨州职业学院,山东滨州 256603)

我国是蛋鸡、肉鸡养殖大国,据统计2021年我国商品蛋鸡存栏量11亿只,肉鸡出栏量高达125亿只,鸡新城疫、H9亚型禽流感和禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)等传染病是目前危害我国养禽业发展的重要病毒性传染病[1-3],严重危害我国的养鸡产业,给养禽业造成了巨大的经济损失。

鸡新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽的一种急性、高度接触性传染病,是危害当前养禽业最严重的禽病之一,世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病,我国在《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)》中,将其列为优先防治的5种一类动物疫病之一。本病主要侵害鸡和火鸡,其中鸡最易感,多呈败血症经过,主要特征是呼吸困难、下痢和神经症状,主要病变为黏膜、浆膜出血[4]。禽流感(Avian influenza,AI)是由H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的以出现呼吸道症状、神经症状、高发病率、心包炎、胰脏多量坏死点或坏死灶,蛋、种鸡产蛋量急剧下降等为主要特征的一种病毒性传染病,主要病变是以鼻腔黏膜发炎,鼻腔和眶下窦充有浆液或黏液,有的病例呈干酪样,鼻咽部和气管黏膜充血,气囊混浊、水肿或有纤维素性炎症为特征[4]。禽腺病毒病又称安卡拉病,是由Ⅰ群4型禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)引起的急性高度致死性传染病,死亡迅速,流行面广,给养禽业造成巨大的经济损失。该病在肉鸡、肉种鸡、蛋鸡、麻鸡、三黄鸡均有发病,各个日龄均可感染,死亡率高,以水平传播为主。剖检最明显的特征是心包腔有黄色或淡黄色积液、肺水肿、肝肿大,部分鸡的肾脏或胰腺出血[5-7]。

疫苗预防接种仍是控制这些家禽传染病的有效手段,但由于禽病的种类多,并且新的疫病及变异株不断出现,使得鸡只不得不多次接种疫苗,这不但费时费力,而且会引起鸡群的应激反应。因此,鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗成为目前我国养鸡市场急需的疫苗产品,免疫一次即可有效控制这3种传染病的发生[8-10]。本研究采用鸡新城疫病毒La Sota株、H9亚型禽流感病毒YT株和禽腺病毒(Ⅰ群4型)QD株制备鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗,并通过测定疫苗对2020-2022年在国内分离的H9亚型禽流感和禽腺病毒(Ⅰ群4型)流行毒株感染的免疫保护情况,为H9亚型禽流感和禽腺病毒病(Ⅰ群4型)的防控以及疫苗的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+YT株+QD株,批号:211107),由山东滨州沃华生物工程有限公司生产。

1.1.2 试验用鸡 21日龄SPF鸡,北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司产品,鸡的品种为白莱航。

1.1.3 攻毒用毒株 3株H9亚型禽流感病毒流行毒株:①A/chicken/Hebei/HD/2020(HD株),②A/chicken/Yunnan/CX/2021(CX株)③A/chicken/Liaoning/DL/2022(DL株)。HD株是2020年10月从河北邯郸某鸡场的病死鸡中分离得到,为河北分离株,AIV(H9)HD株E4代病毒液,108.4EID50/0.1 mL;CX株是2021年12月从云南楚雄某鸡场的病死鸡中分离得到,为云南分离株,AIV(H9)CX株E4代病毒液,108.5EID50/0.1 mL;DL株是2022年5月从辽宁大连某鸡场的病死鸡中分离得到,为辽宁分离株,AIV(H9)DL株E4代病毒液,108.4EID50/0.1 mL。均由山东滨州沃华生物工程有限公司分离、鉴定并保存。

3株禽腺病毒(Ⅰ群4型)流行毒株:① FAdV/chicken/Sichuan/NJ/2020(Ⅰ群,4型)(NJ株) ②FAdV/chicken/Jiangsu/HA/2021 (Ⅰ群,4型)(HA株)③FAdV/chicken/ Hebei/CZ/2022 (Ⅰ群,4型)(CZ株)。NJ株是2020年6月从四川内江某鸡场的病死鸡中分离得到,为四川分离株,NJ株F4代病毒液,107.8TCID50/0.1 mL;HA株是2021年2月从江苏淮安某鸡场的病死鸡中分离得到,为江苏分离株,HA株F4代病毒液,107.5TCID50/ 0.1 mL;CZ株是2022年1月从河北沧州某鸡场的病死鸡中分离得到,为河北分离株,CZ株F4代病毒液,107.6TCID50/0.1 mL。均由山东滨州沃华生物工程有限公司分离、鉴定并保存。

疫苗检验用毒株:H9亚型禽流感病毒YT株、禽腺病毒(Ⅰ群4型)QD株,均由山东滨州沃华生物工程有限公司保管,其中AIV(H9)YT株,毒价为108.5EID50/0.1 mL;FAdV QD株,毒价为107.5TCID50/0.1 mL。

1.1.4 检验用抗原 AI H9亚型HI抗原由山东滨州沃华生物工程有限公司实验室制备提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫接种 取21日龄SPF鸡160只,分为2组,第1组80只,经肌肉注射鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+YT株+QD株),0.3 mL/只;第2组80只,不接种疫苗,作为对照组,每组在同条件下分别隔离饲养。

1.2.2 禽流感H9亚型HI抗体效价测定 免疫后21 d,取免疫鸡40只和对照鸡40只,分别采血,分离血清,用禽流感(H9亚型)血凝抑制试验抗原按文献[11]附录方法进行HI抗体效价测定。

1.2.3 禽流感病毒攻毒保护试验 将采血后的免疫鸡40只和对照鸡40只各随机分为4组,每组10只,分别用AI(H9亚型)YT株、HD株、CX株和DL株进行攻毒,各翅静脉注射禽流感病毒液0.2 mL(含108.0EID50)。攻毒后第5天,分别采集每只鸡的泄殖腔及气管拭子,将同一只鸡的泄殖腔及气管拭子混合后作为1个样品,每个样品经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚5枚,每胚0.2 mL,孵育观察5 d,逐胚测定鸡胚液的HA效价。每个样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚胚液的HA效价不低于1∶16(微量法),即可判为病毒分离阳性,对病毒分离阴性的样品,应盲传1次后再进行判定,以确定新流腺三联苗对4株H9亚型禽流感毒株攻击的保护。

1.2.4 禽腺病毒(Ⅰ群4型)攻毒保护试验 免疫后21 d,取另外免疫鸡40只和对照鸡40只各分为4组,每组10只,分别用FAdV QD株、NJ株、HA株和CZ株进行攻毒,各肌肉注射禽腺病毒(Ⅰ群4型)病毒液0.2 mL(含2×107.0TCID50)。攻毒后观察7 d,结束时进行剖检观察病变,当试验鸡出现死亡或精神沉郁、食欲减退、蜷缩,剖检可见心包积液或肝脾肿大任何一项即判定为发病,记录对照组试验鸡的发病及免疫组试验鸡的保护情况,以确定新流腺三联苗对4株禽腺病毒(Ⅰ群4型)毒株攻击的保护。

2 结果

2.1 禽流感(H9亚型)HI抗体测定结果

新流腺三联灭活疫苗免疫SPF鸡21 d后,取免疫鸡40只和对照鸡40只,分别采血,进行H9亚型AI HI抗体效价测定。结果显示,疫苗免疫后21 d免疫组试验鸡均产生良好的HI抗体水平,几何平均值达到1∶676～1∶832,对照组试验鸡HI抗体均<1∶2(表1)。

表1 新流腺三联苗免后AI HI抗体测定结果

2.2 禽流感(H9亚型)攻毒试验结果

将上述采血后的免疫鸡40只和对照鸡40只各分为4组,每组10只,分别翅静脉注射禽流感(H9亚型)病毒YT株、HD株、CX株和DL株病毒液0.2 mL(含108.0EID50)进行攻毒,攻毒后第5天,采集泄殖腔及气管拭子,尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚进行病毒分离。结果显示,疫苗免疫后用与制苗毒株同源的YT株攻毒后,对照组鸡10/10发病,免疫组鸡10/10保护;用2020-2022年分离的3株AI 流行毒株攻毒后,对照组鸡9/10～10/10发病,免疫组鸡均9/10以上保护。结果表明,新流腺三联灭活疫苗对H9亚型禽流感流行毒株HD株、CX株和DL株强毒攻毒具有良好的免疫保护作用(表2和表3)。

表3 新流腺三联苗免后AIV攻毒试验结果

2.3 禽腺病毒(Ⅰ群4型)攻毒试验结果

免疫后21 d取另外免疫鸡40只和对照鸡40只各随机分为4组,每组10只,分别肌肉注射FAdV QD株、NJ株、HA株和 CZ株病毒液0.2 mL(含2×107.0TCID50)进行攻毒,攻毒后观察7 d,对死亡及存活试验鸡进行剖检观察病变。发现攻毒后第2天对照组试验鸡开始发病,死亡集中在第3～5天,7 d后剖检观察组织病变,发病鸡均出现心包积液、肝脏及肾脏肿大等典型病变,免疫组试验鸡均未见明显异常(图1)。疫苗免疫保护结果显示,用与制苗毒株同源的QD株攻毒后,对照组鸡10/10发病且8/10死亡,免疫组鸡10/10保护;用2020-2022年分离的3株FAdV流行毒株攻毒后,对照组鸡9/10～10/10发病且6/10以上死亡,免疫组鸡均10/10保护。结果表明,新流腺三联灭活疫苗对禽腺病毒(Ⅰ群4型)流行毒株NJ株、HA株和CZ株强毒攻毒具有良好的免疫保护作用(表4)。

图1 对照组和免疫组鸡剖检病变

表4 新流腺三联苗免后FAdV攻毒试验结果

3 讨论

2015年以来,Ⅰ群禽腺病毒病在我国山东、河北、江苏、安徽等多个省份广泛流行,病死率高于30%,给我国养禽业带来严重损失[12]。我国流行毒株主要血清型包括FAdV-4、FAdV-11、FAdV-8a和FAdV-8b等,不同血清型FAdV毒株均能感染鸡且引起鸡心包积液综合征和包涵体肝炎,其中以FAdV-C-4流行范围最广、致病性最高,在家禽养殖中危害最大[13-14]。疫苗预防是疫病控制的重要措施和手段,目前研制的Ⅰ群禽腺病毒病相关生物制品有Ⅰ群4型禽腺病毒病灭活疫苗、Ⅰ群4型禽腺病毒病卵黄抗体、Ⅰ群4型禽腺病毒病亚单位疫苗、新城疫-禽流感(H9亚型)-禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗等[10,15-17],研制出安全、稳定、高效的商品化疫苗,才能实现对该病的有效防控。

采用鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗免疫3周龄SPF鸡,免疫后21日,采血测定禽流感H9亚型HI抗体效价,同时分别用H9亚型禽流感YT株及2020-2022年在国内分离的HD株、CX株和DL株流行毒株进行攻毒,结果显示,免疫组禽流感H9亚型HI抗体效价几何平均值为1∶676～1∶832,对照组试验鸡HI抗体均<1∶2;用H9亚型禽流感病毒YT株、HD株、CX株和DL株攻毒,对照组鸡9/10～10/10发病,免疫组鸡均9/10以上保护。表明采用AI(H9亚型)YT株制备的三联灭活疫苗对近几年流行的H9亚型禽流感分离毒株具有良好的交叉保护作用。

采用鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗免疫3周龄SPF鸡,免疫后21日分别用禽腺病毒(Ⅰ群,4型)QD株及2020-2022年在国内分离的NJ株、HA株和CZ株进行攻毒,结果显示,对照组鸡9/10～10/10发病且至少6/10死亡,免疫组鸡均10/10保护。表明采用FAdV QD株制备的三联灭活疫苗对近几年流行的禽腺病毒(Ⅰ群,4型)分离毒株具有良好的交叉保护效果。

综上表明,鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒病(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+YT株+QD株)对目前禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)国内流行毒株具有良好的保护力,能够有效防控流行毒株的感染。