伊氏锥虫感染的昆明小鼠血常规变化和病理组织学观察

甘 露,诺明达来,郑会珍,金 敏,李永畅,巴音查汗

(新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

伊氏锥虫(Trypanosomaevansi)可在多种哺乳动物血液细胞外增殖[1]。近几年我国新疆马的伊氏锥虫感染率为3.96%,驼感染率为4.62%[2]。伊氏锥虫宿主广泛,除马、骆驼、水牛、牛、猪和犬以外,啮齿动物也易患伊氏锥虫病[3],大多数实验动物(大鼠、小鼠和兔子)易感染[4]。动物感染伊氏锥虫后出现贫血 、免疫抑制、消瘦、神经症状、运动不协调、瘫痪等症状。伊氏锥虫以纵分裂的方式在宿主血液中大量繁殖,分泌或产生大量毒素,这些毒素引起宿主不同的病理反应[5]。伊氏锥虫可穿透组织进入关节液或穿透大脑中的脑脊液[6]。可在动物组织、血浆和空腔液中观察到寄生虫[7]。在组织器官中多见于心、肝、脾、肺和肾等。本文以前期已建立的昆明小鼠伊氏锥虫体内试验模型,通过人工感染马阳性血液,观察小鼠体内血液指标变化及感染伊氏锥虫后脏器组织的病理变化,为探索伊氏锥虫病的诊断治疗及免疫机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及样品 昆明小鼠(KM)6只,均为雌鼠,体重相近,6～8周龄,购自新疆医科大学实验动物中心,试验组和对照组各3只;伊氏锥虫阳性血液,由本实验室前期采集巴州马血液保存于液氮中。

1.1.2 试剂 石蜡(熔点56～58℃),上海懿洋仪器有限公司产品;乙醇,天津永晟精细化工有限公司产品;二甲苯,天津市北联精细化学品开发有限公司产品;其他试剂为苏木素、伊红(醇溶性)和盐酸。

1.1.3 仪器设备 石蜡切片机和显微镜,Leica公司产品;生物组织包埋机,天津市天利航空机电有限公司产品;HH-S数显控温水浴锅;江苏省金坛市医疗仪器厂产品。

1.2 方法

1.2.1 人工感染试验小鼠 试验小鼠腹腔注射阳性马血(PC)0.1 mL,对照组小鼠注射0.9%生理盐水0.1 mL,试验组和对照组饲养条件相同。

1.2.2 试验小鼠血常规检测 采集各组小鼠全血,经全自动血细胞分析仪测定白细胞(WBC)、淋巴细胞(LY)、红细胞(RBC)、血小板平均容积(MPV)、红细胞平均体积(MCV)等17项血常规指标。

1.2.3 小鼠血液涂片制作 试验组接种伊氏锥虫后,6只小鼠每间隔24 h进行尾静脉无菌采血,滴至载玻片涂制成血液涂片,待自然干燥后滴适量甲醇固定;待完全晾干后进行吉姆萨染色[8],染色结束后用蒸馏水将血涂片冲洗干净,自然晾干后滴石蜡油在油镜(10×100)下镜检感染率。

1.2.4 收集试验小鼠脏器 待小鼠感染伊氏锥虫数达到一定高峰并出现死亡时,用心脏采血法对每只小鼠采0.7～0.8 mL全血,4℃保存。将小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏放置双蒸水中清洗30 s,放置固定液中固定48 h,用于组织病理切片的制作。

1.2.5 伊氏锥虫PCR检测 抗凝管无菌采集感染小鼠血液,通过全血基因组试剂盒提取DNA;按照GenBank中发表的伊氏锥虫PFR基因序列(登录号:GQ392136),用Primer 5软件设计1对引物,引物序列和反应条件参考文献[9],PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.6 病理切片制作 分别取心脏、肝脏、脾脏、肾脏各1块,将所取组织块放入包埋盒中,自来水冲洗24 h;然后依次放入70%、80%、90%、95%、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ的乙醇中脱水;再放入二甲苯与乙醇等体积混合液、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ使之透明;将透明的组织块放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ中,使其充分浸蜡后包埋,切片及展片,然后放入恒温箱中过夜;其中脱水透明和浸蜡的时间可根据组织块的大小和质地适当调整[10]。

HE染色:二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ 5 min→无水乙醇Ⅰ 2 min→无水乙醇Ⅱ 2 min→95%乙醇 2 min→85%乙醇 2 min→70%乙醇 2 min→50%乙醇 2 min→纯化水洗片3 min→苏木精染液5～10 min→纯化水洗片刻3 min→1%盐酸乙醇分化5～30 s→自来水洗碱化(返蓝) 10～20 min→纯化水洗片3 min→50%乙醇 1 min→70%乙醇 1 min→85%乙醇 1 min→95%乙醇 2 min→0.5%伊红 2 min→纯化水洗片3 min→95%乙醇Ⅰ2 min→95%乙醇Ⅱ2 min→无水乙醇Ⅰ2 min→无水乙醇Ⅱ2 min→二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ 5～10 min→树胶封片[11]。

2 结果

2.1 血常规检测结果

随着感染天数的增加,试验小鼠WBC、NEU、HCT、MCH、PLT值逐渐降低,LYM%、MCV、RDWR-SD、MPV值在死亡时明显升高。健康小鼠血常规未见明显异常(表1)。

表1 小鼠血常规变化

2.2 试验组与对照组小鼠器官大小对比

对比试验组和对照组小鼠各器官大小(长×宽),发现试验组小鼠脾脏、肝脏,心脏均明显变大,肺脏及肾脏变化较小(表2)。

表2 小鼠各器官大小比较

2.3 血涂片和PCR检测结果

感染小鼠血涂片显示,血液中含大量伊氏锥虫(图1A),对照组小鼠红细胞正常(图1B)。PCR检测到799 bp的目的条带,与预期大小相符(图2),根据血涂片和PCR结果,发现试验小鼠体内存在伊氏锥虫。

A.试验组;B.对照组

M.DNA标准DL 2 000;1～3.感染小鼠;4～6.对照组;7.阴性

2.4 小鼠主要器官病理变化

试验小鼠脾脏淤血,髓质间有大量红细胞,有较多形态改变的淋巴滤泡;肝脏中央静脉、小叶间静脉淤血,肝细胞肿胀,肝窦间隙变窄;肺泡肿胀,肺泡壁增宽,支气管出现纤维化,间质可见炎症细胞;心脏中心肌纤维肿胀,出现颗粒变性,染色后颜色加深,并伴有较多的伊氏锥虫体;肾小囊间隙变窄,肾小管上皮细胞肿胀,管腔变窄;对照组小鼠均未出现明显病理变化(图3)。

A.脾脏(40×);C.肝脏(40×);E.肺脏(40×);G.心脏(40×);I.心脏(40×);K.肾脏(40×);B.脾脏(100×);D.肝脏(100×);F.肺脏(100×);H.心脏(100×);J.心脏(100×);L.肾脏(100×)

3 讨论

本研究发现,白细胞数随着感染伊氏锥虫的天数呈逐渐下降的趋势,伊氏锥虫是一种血鞭毛寄生虫,可以生活在液体中,白细胞的减少会造成血液系统疾病,这与血常规中血小板数值相符合,血小板的降低说明造血功能出现障碍。嗜酸性粒细胞(EOS)是白细胞的一部分,占白细胞总数的0.5%～5%,在寄生虫侵入时极为敏感。过敏反应、寄生虫感染和其他免疫反应中嗜酸性粒细胞极为活跃[12],嗜酸性粒细胞显著上升。本试验中,中性粒细胞(NEU)和淋巴细胞(LYM)逐渐下降,说明自身的免疫系统遭到破坏,中心粒细胞是一类白细胞,两者细胞计数下降和脾脏的肿大相关联。通过血常规发现,试验小鼠血小板体积增多,而血小板(凝血细胞)是血液中凝血思想因素,可能由于采血时血液未能及时和肝素混合而导致的。而红细胞压积(HCT),红细胞(RBC)显著下降,可能是受到伊氏锥虫大量增殖的影响,感染小鼠营养不良出现贫血现象。

伊氏锥虫对小鼠具有较高的致病性,感染伊氏锥虫的小鼠红细胞压积下降,白细胞增多;感染小鼠不同内脏器官病理组织切片中观察到锥虫,特别是在肝脏、脾脏和心脏血管内,而未感染小鼠体内未发现明显变化,本研究可为伊氏锥虫病的诊断与预防提供理论依据。