TBX2基因在头颈鳞癌中甲基化相关的预后分析

昝雨欣，丁 妍

1. 湖北医药学院生物医药研究院（湖北十堰 442000）

2. 湖北医药学院附属太和医院生命科学研究所（湖北十堰 442000）

3. 胚胎干细胞研究湖北省重点实验室（湖北十堰 442000）

头颈鳞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）已在头部和颈部的各个区域检测到，诊断时存在远处转移，这与HNSCC 的高死亡率相关[1]。已有较多研究表明，基因甲基化影响HNSCC 的进展，如通过m7G 修饰的METTL1、m6A 修饰的RBM15及m5C 调控基因会促进或抑制HNSCC 细胞的侵袭、迁移和凋亡[2]。在成熟体细胞组织中，DNA 甲基化一般发生于CpG 双核苷酸（cg 位点）部位，促甲状腺激素释放激素基因cg01009664 位点在健康细胞和口腔鳞状癌细胞之间的甲基化水平差异最大，但关于HNSCC 其他亚类与cg 位点的研究较少[3]。

TBX2是T-box 家族成员之一，在多种癌症中过表达。其甲基化与缺血性脑卒中、非小细胞肺癌、横纹肌肉瘤等有密切联系，但较少有TBX2基因甲基化和HNSCC 相关性和预后的研究[4]。本文基于数据库研究阐明HNSCC 中TBX2基因表达与临床病理参数和预后价值的关联，进一步探索TBX2的甲基化cg 位点与HNSCC 预后的关系。

1 资料与方法

1.1 数据预处理和差异表达分析

从UCSC Xena 数据库（http://xena.ucsc.edu/）[5]下载HNSCC 癌症样本和正常样本的mRNA 表达谱、相关临床数据和甲基化文件（TCGA-HNSC.methylation450.tsv）；采用Perl软件从HNSCC 的HTSeq 中提取TBX2的mRNA 表达；从基因表达综合（Gene Expression Omnibus, GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[6]下载GSE 6631、GSE 2379、GSE 83519 相关数据集，与健康对照相比；使用R 软件ggpubr 包计算HNSCC癌症样本和对照样本的TBX2mRNA的差异表达。

1.2 TBX2在HNSCC中的蛋白表达

人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas,HPA）数据库（https://www.Proteinatlas.org/）[7]包含有关人体组织和细胞的蛋白质分布信息，在该数据库输入目的基因TBX2，选择HNSCC 下的“单细胞”和“免疫组织化学”板块。分析TBX2在HNSCC 组织和细胞水平上的蛋白差异表达。

1.3 TBX2在HNSCC中的临床预后

UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）[8]是一个交互式门户网站，用于绘制生存曲线和进行临床病理差异分析。在网站输入目的基因TBX2，链接窗口下选择“生存”和“甲基化”板块，分析HNSCC 患者不同临床病理因素中TBX2mRNA表达与其预后的相关性。

1.4 TBX2 mRNA的表达和甲基化水平

UALCAN 用于研究HNSCC 中TBX2的启动子甲基化水平。采用Perl 软件分析“TCGA-HNSC.methylation450.tsv”文件中TBX2的甲基化水平。采用R 语言plyr 和ggpubr 包绘制甲基化箱线图；采用R 软件包dplyr 和ggpubr 分析TBX2DNA 启动子区域cg 位点的甲基化水平。

1.5 cg位点甲基化水平和TBX2 mRNA表达的存活分析

基于TBX2mRNA 表达和甲基化水平将HNSCC 患者分为高表达组和低表达组。采用R软件包survminer 和survival 对高表达组和低表达组进行生存分析。

1.6 TBX2单基因富集分析

以MSigDB 数据库（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）[9]中的c2.cp.kegg.v7.5.1.symbols.gmt 和c5.go.v7.5.1.symbols.gmt 数据集作为功能基因集，对TBX2进行单基因功能和通路富集（错误发现率＜0.05）。

1.7 统计分析

采用R 软件（v4.1.3）对数据进行分析，采用Kaplan-Meier 分析计算HNSCC 高表达组和低表达组之间的生存差异，Spearman 相关性分析法计算TBX2基因甲基化水平和基因表达之间的关系。基于组间差异的卡方检验估计分类变量，采用Kruskal-Wallis 检验分析连续变量。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TBX2在HNSCC和正常组织中的表达

TBX2在HNSCC 肿瘤组中mRNA 表达高于对照组（P＜0.001），见图1-A；通过GEO 数据库的RNA-seq 数据进一步分析发现，TBX2在肿瘤组中的表达明显升高（P＜0.05），见图1-B；通过HPA 数据库分析发现，TBX2的蛋白表达在肿瘤组中升高，多集中于细胞核（图1-C），在HNSCC 细胞系中其多表达于RPMI-2650 细胞系（图1-D）。

图1 TBX2在HNSCC和正常组织中的表达Figure 1. Expression of TBX2 in HNSCC and normal tissues

2.2 TBX2表达与临床病理特征的关系

通过Kaplan-Meier 分析评估TBX2表达与患者生存期之间的关系，未发现显著差异（P=0.53），见图2-A；在TBX2mRNA 表达水平与HNSCC 患者临床病理特征进展关系方面，随着年龄增长，其表达随之上升（图2-B）；在临床分级中，肿瘤组中的1、2、3、4 级TBX2表达均高于对照组（P＜0.001），在临床分期中，肿瘤组中的1、2、3、4 级TBX2表达均高于对照组（P＜0.05），见图2-C、图2-D。

图2 TBX2的预后和临床病理特征Figure 2. Prognostic and clinicopathologic characteristics of TBX2

2.3 TBX2在HNSCC中甲基化水平与mRNA表达的相关性

在UALCAN 数据库中，甲基化分析板块包含528 份HNSCC 样品和50 份正常样品。结果显示，与正常样本相比，HNSCC 组织中TBX2基因的甲基化程度较高（P＜0.01），见图3-A。“TCGA-HNSC.methylation450.tsv”文件共包含580 份样品，TBX2基因中有22 个甲基化CG 位点（图3-B）。TBX2甲基化水平与mRNA 呈负相关（r=-0.19，P＜0.001）， 见图3-C。TBX2六个不同位点（cg11031701、cg19021197、cg27027242、cg12163132、cg10930156、cg02577108）甲基化水平与mRNA 呈显著负相关（P＜0.05），见图3-D，与其他位点相关性差异不显著（P＞0.05）。

图3 TBX2基因甲基化水平与mRNA表达的相关性Figure 3. Correlation between methylation level of TBX2 gene and mRNA expression

2.4 TBX2在HNSCC中各甲基化cg位点的预后

TBX2甲基化水平低的cg 位点（cg13274713、cg02577108、cg10492801、cg04304770、cg05162750、cg10930156）与不良OS相关（图4-A），TBX2的cg位点（cg13274713、cg04304770、cg02577108、cg21977256、cg26932779、cg27027242、cg10492801、cg22449107）的低甲基化水平与不良PFS 相关（图4-B），而其他甲基化cg 位点与HNSCC 患者的预后无关。

图4 TBX2基因甲基化与临床病理参数的关联Figure 4. Association of TBX2 gene methylation with clinicopathological parameters

2.5 TBX2通过基因集富集分析进行通路富集

采用基因富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）探究TBX2对HNSCC 主要生物学过程的影响。基因本体（gene ontology, GO）功能富集分析结果显示，TBX2主要富集于生物过程（biological process, BP）中非编码RNA3'端加工、小核RNA 代谢过程、翻译起始等；细胞组成（cellular component, CC）有免疫球蛋白复合物；分子功能（molecular function, MF）有翻译调节剂活性核酸结合等（图5-A）。从京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）基因集中富集到通路包括钙信号通路、黏着斑、黑色素瘤、神经活性配体与受体相互作用、蛋白酶体等（图5-B）。

图5 GSEA通路富集Figure 5. Enrichment of GSEA pathways

3 讨论

TBX2编码参与发育过程调控的转录因子可作为诊断和预后生物标志物，甚至是新的治疗靶点。目前仅有少量研究探索HNSCC 中TBX2表达与临床病理参数和预后的关系。在喉癌、甲状腺乳头状癌和鼻咽癌中，TBX2的mRNA 表达水平上调，且与淋巴结转移、分化程度相关，但在HNSCC 中鲜有报道[10]。本研究探讨了TBX2在HNSCC 中的表达和甲基化及其临床病理参数和预后的关系，发现TBX2mRNA 和蛋白表达显著高于邻近正常组织，不同TBX2表达水平HNSCC患者的OS 无明显差异，TBX2基因部分cg 位点甲基化水平与OS 和PFS 显著相关，TBX2是HNSCC 中重要的诊断和预后生物标志物。

异常的DNA 甲基化已被证实会改变肿瘤微环境，可用于疾病诊断和预后预测。甲基化谱对于鉴定基因的功能状态至关重要，因其表达依赖于DNA CpG 岛的甲基化状态。根据文献，某些基因的异常DNA 甲基化可能在HNSCC 病理生理和发展中起着关键作用[11]。DNA 甲基化异常可使与细胞增殖相关的基因表达异常，从而导致细胞增殖异常。早期研究表明，同源重组DNA 修复途径中XRCC3 c.722、Lig4 c.26 和Rad51 c.3429单核苷酸多态性与HNSCC 风险之间显著相关，而单核苷酸多态性在CG 序列上出现最为频繁[12]。本研究探讨了cg 位点的甲基化水平与预后之间的关联，结果显示，与健康对照组相比，HNSCC 中的TBX2表达较高，但甲基化同样较高。此外，TBX2甲基化水平低的cg 位点（cg13274713、cg02577108、cg10492801、cg04304770、cg05162750、cg10930156）与不良OS相关，TBX2cg位点（cg13274713、cg04304770、cg02577108、cg21977256、cg26932779、cg27027242、cg10492801、cg22449107）的低甲基化水平与不良PFS 有关， 提示cg13274713、cg02577108、cg10492801、cg04304770 这4 个位点是未来研究的重点，可能被用作HNSCC 的预后和治疗靶点。由于有关TBX2基因的cg 位点研究有限，现仅发现其在高血压中具有易感性[13]。

为进一步探讨TBX2导致肿瘤发生的具体机制，本研究采用GSEA 探究了TBX2对HNSCC 主要生物学过程的影响。GO 富集分析到分子功能翻译调节剂活性核酸结合。不论是非编码RNA相关n6-甲基腺苷对免疫球蛋白的识别和3'端加工，还是小核仁RNA 都已被证明通过28'-O-甲基化修饰在癌症发展中起着关键的调节作用，证实基因甲基化及其潜在的cg 位点在肿瘤预后中发挥着潜在作用[14-15]。从KEGG 基因集分析中富集到通路包括钙信号通路、神经活性配体与受体相互作用、蛋白酶体和细胞外基质。有研究指出蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗头颈癌，TBX2可诱导HAS2基因表达并增加透明质酸沉积，从而重塑肿瘤微环境[16]。早期有研究显示，原发癌细胞向远处器官的转移被认为是由上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）诱导控制的，TBX2可能通过调节EMT 和转移前生态位的建立，在许多恶性肿瘤的转移中起着至关重要的作用，TBX2过表达通过EMT 和ERK 信号通路促进胃癌增殖和侵袭，E-钙黏蛋白增加可抑制细胞入侵[17]。研究表明TBX2抑制明显增加了E-钙黏蛋白的表达，并且抑制了体外鼻咽癌细胞的侵入与迁移[10]。生信结果与已有基础研究结果相互验证，但TBX2对HNSCC 的生物学过程还需要基础实验进一步验证。

本研究存在一定的局限性，尽管采用了生物信息分析，但缺乏了实际临床研究，降低了研究的可行性。综上所述，TBX2表达与HNSCC 患者的肿瘤分级分期有关，但与OS 无关。此外，与正常样本相比，HNSCC 组织中TBX2基因的甲基化程度较高，TBX2基因中某些cg 位点的低甲基化水平与不良的OS 和PFS 密切相关。整合甲基化和基因表达分析支持TBX2作为HNSCC 中的特异性诊断和预后生物标志物。