不同冷冻方法对犬精液冷冻效果的影响

宫晓东 郜 旭 董 岩 亓光斌 徐 可

精液冷冻保存是种质资源保存利用的重要方法之一，寻找一种廉价、高效的冷冻方法自精液冷冻技术诞生以来便是人们努力的方向。目前精液冷冻主要有三种方法，即程序冷冻、液氮熏蒸和颗粒冷冻。这三种方法各有利弊，本实验将对三种方法冷冻效果做一个对比，以供选择冷冻方法时作为参考。

一、材料方法

（一）材料试剂

冷冻液使用前加20%蛋黄混匀后冷藏备用。瑞式吉姆萨染液购自索莱宝。其他试剂如无特殊说明均为国药集团沪试AR 级。

精液质量分析系统（CASA）为TYCASA.V1.0，程序冷冻仪为TYLDY-900，红宝石精子计数板为上海微图10μm 款。

实验动物品种为柯基犬。

（二）精液采集与处理

1.采精

选择6 头2～3 岁柯基种公犬，每周采精一次，2023 年5 ～6 月共采精7 次，合计42 头次。用湿纸巾擦净阴茎外部，按摩法采精，用漏斗和15mL 离心管收集精液，只保留第二段富含精子部分。精液采集后迅速送至实验室，按照1∶1 加入35℃预热的冷冻I 液，然后将盛装稀释后精液的离心管置于装有150mL35℃水的250mL 烧杯中，将烧杯置于冰箱冷藏室降温平衡3h。然后用4℃预冷的含甘油的II 液进行1∶1 稀释。稀释好的精液分出2/3 在4℃条件下使用全自动灌装封口一体机进行灌装封口，剂型为0.25mL 细管。剩下1/3 用于颗粒冷冻。

2.冷冻

灌装好的细管精液，一半用程序冷冻仪冷冻，冷冻程序为5℃～-10℃，-3℃/min；-10℃～-100℃，-40℃/min；-100 ～-140℃，-20℃/min；-140℃恒温5min，然后投入液氮。另一半用泡沫箱熏蒸，熏蒸高度为5cm，熏蒸时间20min，然后投入液氮。

颗粒冷冻程序参考张江等的方法，并根据具体情况有所改变：将铝饭盒在液氮面2cm 处预冷至-120℃，然后用配7 号针头的2.5mL 注射器将稀释好的精液滴在铝饭盒上，每滴约50μL，熏蒸3 ～5min，待颗粒冻结后沉入液氮，并收集在冻存管中，每个冻存管放10 粒。

3.解冻

细管冻精采用37℃水浴解冻40s。颗粒冻精采用干式解冻法，将10mL干洁玻璃试管在37℃水中预热，然后将一个冻存管中的10 粒颗粒冻精全部倒入玻璃试管中，并不停晃动试管，直到所有颗粒均融化完全，继续恒温至少1min。

（三）精液质量检测

1.密度和运动参数

精子密度，前向运动精子比例（PM），运动精子比例（TM）以及其他运动参数均由CASA 完成。检测条件为10X 物镜，负相差模式。程序冷冻组和熏蒸组每次取2支解冻混合，颗粒冷冻组取10 粒，每个样滴检测4 个视野，取平均值。所有检测均要求在解冻后10min 内完成。各运动参数含义见表1。

表1 精子运动参数表

2.畸形率和顶体完整率

采用瑞氏吉姆萨染液对精子进行染色，染色方法按照试剂说明书进行操作。简单来说，即将染色液约500μL 滴到甲醇固定好的精子涂片上1min，然后滴加等量磷酸盐缓冲液，轻轻晃动玻片，使染液与缓冲液混匀，继续染色3 ～5min，然后用流水轻轻冲走染色液。在40X 物镜下观察畸形率，100X 油镜下观察顶体完整率，每个样品涂2 张片子，每个片子至少数200 条精子，并且两张片子误差不能超过5%，否则重新涂片染色。

3.质膜完整性

采用低渗肿胀实验（HOST）检测质膜完整性。配制75mmol/L 果糖和25mmol/L 柠檬酸的低渗透压水溶液(100mmol/L)。取20μL 解冻精液用低渗液稀释10 倍，在37℃水浴15min 后在400X 下观察至少200 条精子，每个样品观察2 次。尾部卷曲的精子为质膜完整精子，质膜完整的精子所占比例即为质膜完整率。

（四）数据处理与分析

所有数据使用WPS Excel 汇总整理，使用SPSS 23.0 进行多变量双因素方差分析（固定效应为犬号、冷冻方法，只考虑主效应），事后使用LSD 法对不同冷冻方法进行两两比较。显著水平设为0.05。所有结果表示为“平均值±标准误”，上角标不同字母表示差异显著。

二、实验结果

（一）不同冷冻方法对解冻PM 和TM 的影响

如表2 所示，程序冷冻组解冻PM 为48.98±0.58，显著高于液氮熏蒸组45.53±0.53 和颗粒冷冻组46.62±0.57，颗粒冷冻组高于液氮熏蒸组，但差异不显著。程序冷冻组TM 为70.42±0.79，显著高于液氮熏蒸组的68.11±0.72，但两组均与颗粒冷冻组68.83±0.95 差异不显著。

（二）不同冷冻方法对运动参数的影响

如表3 所示，程序冷冻组VSL 为36.94±0.32μm/s， 显著高于液氮熏蒸 组35.80±0.28μm/s， 颗粒冷冻组36.53±0.29μm/s 与程序冷冻组和液氮熏蒸组差异均不显著；程序冷冻组VCL 为83.73±1.32μm/s，显著高于液氮熏蒸组79.58±1.07μm/s，但这两组均与颗粒冷冻组80.82±1.24μm/s 差异不显著；程序冷冻组ALH 为5.53±0.06μm，显著高于液氮熏蒸组5.30±0.06μm，但与颗粒冷冻组5.39±0.06μm 差异均不显著；程序冷冻组BCF 为7.80±0.06Hz，显著高于液氮熏蒸组的7.55±0.05Hz，以及颗粒冷冻组的7.66±0.06Hz；液氮熏蒸组和程序冷冻组MAD 分别为52.52±1.04°、52.09±1.06°，均显著低于颗粒冷冻组的55.57±1.11°。VAP、STR、LIN 和WOB 等其他指标上三种冷冻方式均无显著差异。

表3 不同冷冻方法对运动参数的影响

（三）不同冷冻方法对畸形率、顶体完整率和质膜完整率的影响

如表4 所示，不同冷冻方式对畸形率、顶体完整率和质膜完整率均没有显著影响。

表4 不同冷冻方法对畸形率、顶体完整率和质膜完整率的影响

表 不同冷冻方法对解冻PM 和TM 的影响

三、讨论

影响精液冷冻效果的因素很多，比如犬的个体差异以及营养状况、气候等环境因素，但犬的个体差异和环境因素不易控制。尽管如此，也可以通过巧妙的实验设计将这些难以控制因素的影响减小，比如配对设计或者随机区组设计等，从而提高实验精度。就本实验而言，所有实验组均使用同一种冷冻液，除了冷冻和解冻方法有差异外，其他处理均完全一致，最大程度实现了条件控制，并且通过将犬的个体纳入实验因素考虑，然后通过双因素方差分析的方法将其影响剔除，提高了实验检验精度，因此即使程序冷冻组PM 仅比其他组高出2.36 也能达到显著的水平。

更可控的因素是冷冻液、冷冻方法和解冻方法等冷冻工艺方面的因素。在三种冷冻方式中，程序冷冻的方式对冷冻过程的控制程度最大，但冷冻效果取决于具体的冷冻曲线；颗粒冷冻和液氮熏蒸方式对冷冻过程的控制程度均相对更弱，冷冻过程温度控制精度更低，因此冷冻效果更容易受到环境温度、气流等随机因素的影响，这可能就是其冷冻效果相对较差的原因之一，这也与吴衍等的结果一致。

颗粒冷冻降温迅速，可以更快地度过危险的结冰温区，然而颗粒冻精不易标记，容易污染，使用起来也不如细管冻精方便，因而现在几乎被细管冻精淘汰。液氮熏蒸法操作简单，成本低廉，仅需要控制细管到液氮面的距离即可获得较好的结果，但泡沫箱保温性能、环境温度等都会影响液氮面同一高度的温度，并且该温度还会随着时间而变化并不稳定。程序冷冻仪会对降温曲线进行实时控制，确保冷冻过程不偏离设定。程序冷冻仪价格相对于另外两种方法昂贵得多，要充分发挥冷冻仪的作用需要研究更适宜的冷冻曲线。相较而言，液氮熏蒸和颗粒冷冻过程，冷冻过程难以精确控制，因此通过改变冷冻曲线提升效果的潜力十分有限；而程序冷冻仪则可以精确控制冷冻的全过程，因而通过改变冷冻曲线提升效果的潜力大得多。本实验所用冷冻曲线效果较好，但未必是最优的曲线，还应该继续优化。