基于SATB2/nox4信号通路探讨miR-182-5p对结肠癌细胞增殖和迁移的调控作用

杨振 贾陌杨 魏传奎 刘建刚

(山东第一医科大学第二附属医院 1普外科,山东 泰安 271000;2消化科)

结肠癌是胃肠道恶性肿瘤之一,是全球第三大常见癌症〔1〕。近年来,人们的饮食结构发生了一定的变化,结肠癌发病率呈现逐年上升趋势,且发病率与死亡率均位列恶性肿瘤中的前五〔2〕。结肠癌的发病机制目前尚未明确,遗传、吸烟、饮酒、年龄、肥胖等均为引发结肠癌的危险因素〔3〕。结肠癌临床症状较为隐匿,确诊时多已发展至晚期,转移率与复发率较早期明显升高,对患者预后和远期生存皆不利〔4〕。因此,探索结肠癌发病机制中的关键调控分子、揭示其迁移的具体机制,对结肠癌的防治具有重要的理论价值。miRNA具有对肿瘤细胞增殖、凋亡等过程的调控作用,多项研究表明,miR-182-5p在结直肠癌、乳腺癌、肝癌等癌症中呈高表达,对癌细胞的恶性生物学行为起促进作用〔5～7〕。特定富含AT碱基DNA序列结合蛋白(SATB)2是一种核基质结合蛋白,在结肠癌组织中呈低表达,Chen等〔8〕研究表明,低水平SATB2与结肠癌的发生发展及转移关系密切,Kinget等〔9〕发现,miR-182-5p对SATB2具有靶向调控作用。本研究通过检测miR-182-5p、SATB2与SATB2/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nox)4通路相关蛋白在结肠癌组织与细胞中表达,观察细胞增殖、迁移能力的变化,并分析miR-182-5p与SATB2/nox4间的调节关系。

1 材料和方法

1.1组织样本 收集山东第一医科大学第二附属医院2019年3～8月手术切除的43例结肠癌与癌旁正常结肠组织,组织均接受术后病理诊断鉴定〔10〕。其中男26例,女17例,年龄54～71〔平均(61.76±6.44)〕岁。TNM分期：Ⅰ期17例,Ⅱ期12例,Ⅲ期14例;分化程度：低分化12例,中分化24例,高分化7例;左半结肠癌23例,右半结肠癌20例。本研究已通过医院伦理委员会批准,患者均知情同意并自愿提供组织样本。

1.2研究材料 人结肠癌细胞株SW480(货号CL-0223)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;DMEM高糖培养基(货号11965092)、胎牛血清(货号16140063)、Trizol试剂(货号15596018)、mirVana miRNA分离试剂盒(货号AM1561)购自美国Thermo Fisher公司;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(货号RR820A)购自大连宝生生物科技有限公司;All-in-One miRNA实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒(货号QP016/AOMD-Q060)购自亚太恒信生物科技(北京)有限公司;慢病毒表达载体的构建、鉴定、包装与滴度测定由广州辉骏生物科技股份有限公司完成;PCR引物与内参购自镜像绮点(上海)细胞技术有限公司;十二烷基硫酸钠(SDS)裂解液(货号P0013G)、噻唑蓝(MTT)细胞检测试剂盒(货号C0009S)、二喹啉甲酸(BCA)检测试剂盒(货号P0012)购自上海碧云天生物技术有限公司;兔IgG抗体(货号ab172730)、兔SATB2(货号ab92446)、兔nox4(货号ab133303)、兔E-钙黏蛋白(E-cadherin,货号ab40772)、兔波形蛋白(Vimentin,货号ab137321)购自美国Abcam公司;SP法免疫组化试剂盒(货号PH1698)购自福州飞净生物科技有限公司。

1.3细胞培养与分组 使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养细胞。SW480分为对照组(不进行处理)、NC-mimics组(转染NC-mimics)、miR-182-5p-mimics组(转染miR-182-5p-mimics)、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC组(转染miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC)、miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2组(转染miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2)、NC-inhibitor组(转染NC-inhibitor)、miR-182-5p-inhibitor组(转染miR-182-5p-inhibitor)。按照分组进行慢病毒转染,48 h后收集细胞用于后续相应实验。

1.4双荧光素酶报告基因检测 使用生物信息学数据库TargetScanHuman预测分析miR-182-5p和SATB2的结合位点,构建野生型(WT)和突变型(MUT)荧光质粒：psiCheck2-SATB2-Luc、psiCheck2-SATB2-MUT-Luc,并与miR-182-5p模拟物共转染至SW480细胞中,检测荧光素酶活性。

1.5qRT-PCR检测组织miR-182-5p、SATB2与细胞miR-182-5p、SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin水平 组织、细胞使用Trizol试剂、mirVana miRNA分离试剂盒提取组织、细胞总RNA、miRNAs。总RNA反转录成cDNA,使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒配制20 μl PCR体系。miRNAs用All-in-One miRNA qRT-PCR试剂盒进行检测。引物序列(5′-3′)为：miR-182-5p正向：ACGTGATGCTGATGCTGCG,反向：TAGCGTAGCTGTACTGTGC;U6正向：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT,反向：ACGCTTCA CGAATTTGCGTGTC;SATB2正向：TGTAGCTGTAG CTGTAGTGCAC,反向：GTAGCTGATCGTAGTGCTGTAT;nox4正向：TAGCTGATCGTGATGCTGTAGC,反向：CGGTATCGTTACTGTAGTCGTA;E-cadherin正向：TAGCTGTAGTCGTGATCGTAGT,反向：GTCATGCTGTAGTGCTGATGCG;Vimentin正向：CTAGCTGTAGCTGTAGTGCTGTC,反向：GCTGATGCTGTAGCTGTAGCTC;β-actin正向：ATGCATCTGCTGATGCGTACTG,反向：GCTGATGCTGTAGCTGTAGCTC。应用2-ΔΔCt法计算miR-182-5p、SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin的相对表达水平。

1.6染色质免疫共沉淀 对照组细胞培养覆盖率达到90%后,加入37%多聚甲醛,室温交联10 min后加入浓度为0.125 mol/L的甘氨酸终止交联。吸出细胞培养基,加入预冷1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗两遍,刮下细胞并于4 ℃、2 000 r/min条件下离心2 min。收集细胞沉淀,加入SDS裂解液后超声破碎,收集上清液并分为IgG阴性对照组和SATB2组,加入protein A磁珠与相应抗体后置于4 ℃过夜。洗涤沉淀复合物,设计miR-182-5p的ChIP引物为正向：5′-GAGTGTCCAGGGTTCGTCTG-3′,反向：5′-GGTACACTTCTTTGCCCCCA-3′,qRT-PCR分析洗涤后的DNA片段,用2-ΔΔCt法计算相对值。

1.7MTT法检测细胞增殖能力 对照组、NC-mimics组、miR-182-5p-mimics组、NC-inhibitor组、miR-182-5p-inhibitor组细胞接种于96孔板上,接种密度5×103个/孔,每孔100 μl,培养24、48、72、96 h后每孔加入浓度为5 mg/ml的MTT试剂10 μl,37 ℃孵育4 h后除去上清液,每孔加入100 μl二甲基亚砜,酶标仪570 nm测定吸光度(OD)值。重复3次。

1.8划痕实验检测细胞迁移能力 对照组、NC-mimics组、miR-182-5p-mimics组、NC-inhibitor组、miR-182-5p-inhibitor组细胞接种于6孔板中,接种密度1×106个/孔。待细胞铺满90%,用200 μl移液器枪头作划痕,清除脱落的细胞,加入无血清培养基继续培养24 h。于划痕后(0 h)、培养24 h后拍照,测量划痕宽度,计算细胞迁移率。

1.9Western印迹检测SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin表达 收集对照组、NC-mimics组、miR-182-5p-mimics组、NC-inhibitor组、miR-182-5p-inhibitor组细胞沉淀,经裂解液充分裂解后于4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min,保留上清液,BCA定量后制样。经电泳、转膜,截取目的条带浸于封闭液中,室温封闭1 h。加入稀释比例为1∶500的一抗孵育液,4 ℃环境下过夜。加入稀释比例为1∶5 000的对应二抗孵育液,室温孵育2 h,洗膜后加入电化学发光(ECL),避光反应5 min,收集荧光图像结果。

1.10体内异种移植实验 对照组、NC-mimics组、miR-182-5p-mimics组、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC组、miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2组细胞制成5×107个/ml的单细胞悬液。裸鼠按照各组细胞名称随机分组,每组6只。原位接种细胞悬液,3 w后处死裸鼠,完整取出肿瘤,拍照称重后置于10%甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋制成切片。

1.11免疫组化检测肿瘤组织SATB2、nox4表达情况 采用免疫组化SP法检测裸鼠肿瘤组织SATB2、nox4表达。按照试剂盒要求处理石蜡切片并进行染色操作,光镜下拍摄实验结果,用ImageJ软件分析图像,计算SATB2、nox4相对表达量。

1.12统计学方法 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-182-5p和SATB2在结肠癌中表达 结肠癌组织miR-182-5p相对表达量(1.47±0.08)明显高于癌旁组织(1.00±0.05;t=32.716,P=0.000),结肠癌组织中SATB2相对表达量(0.20±0.04)明显低于癌旁组织(0.49±0.07;t=24.608,P=0.000)。miR-182-5p与SATB2水平呈负相关(r=-0.655 2,P<0.000 1)。见图1。

图1 miR-182-5p与SATB2相关性

2.2miR-182-5p靶向调控SATB2表达 miR-182-5p与SATB2存在结合位点(图2)。miR-182-5p能够明显降低野生型3′UTR的SATB2荧光素酶活性(P<0.05),对突变型3′UTR的SATB2荧光素酶活性没有影响(P>0.05),说明miR-182-5p能够直接靶向作用于SATB2。染色质免疫共沉淀结果显示,过表达SATB2导致miR-182-5p与SATB2的结合能力明显下降(P<0.05)。见表1、表2。

表1 双荧光素酶报告基因检测结果

表2 染色质免疫共沉淀检测

图2 miR-182-5p靶向调控SATB2表达

2.3miR-182-5p增强结肠癌细胞增殖、迁移能力 MTT检测结果显示,对照组、NC-mimics组、NC-inhibitor组细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05);与对照组、NC-mimics组、NC-inhibitor组相比,miR-182-5p-mimics组细胞增殖能力明显增强(P<0.05),miR-182-5p-inhibitor组细胞增殖能力明显降低(P<0.05)。划痕实验结果显示,对照组、NC-mimics组、NC-inhibitor组细胞迁移率差异无统计学意义(P>0.05);与对照组、NC-mimics组、NC-inhibitor组相比,miR-182-5p-mimics组细胞迁移率明显升高(P<0.05),miR-182-5p-inhibitor组细胞迁移率明显降低(P<0.05)。见图3、表3。

表3 各组细胞增殖能力、迁移率比较比较

图3 miR-182-5p增强结肠癌细胞迁移能力(×200)

2.4miR-182-5p影响SATB2/nox4信号通路 对照组、NC-mimics组、NC-inhibitor组SATB2、nox4、E-cadherin、Vimentin mRNA与蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与对照组、NC-mimics组、NC-inhibitor组相比,miR-182-5p-mimics组SATB2、E-cadherin mRNA与蛋白表达量明显下降,nox4、Vimentin mRNA与蛋白表达量明显升高,miR-182-5p-inhibitor组SATB2、E-cadherin mRNA与蛋白表达量明显升高,nox4、Vimentin mRNA与蛋白表达量明显下降(P<0.05)。见表4、图4。

1～5：对照组、NC-mimics组、miR-182-5p-mimics组、NC-inhibitor组、miR-182-5p-inhibitor组 图4 各组SATB2/nox4信号通路相关蛋白表达

表4 各组SATB2/nox4信号通路相关蛋白与mRNA表达比较

2.5SATB2逆转miR-182-5p对结肠癌细胞恶性生物学行为的增强作用 对照组、NC-mimics组肿瘤体积、质量差异无统计学意义(P>0.05),miR-182-5p-mimics组、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC组肿瘤体积、质量差异无统计学意义(P>0.05);与对照组、NC-mimics组相比,miR-182-5p-mimics组、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC组肿瘤体积、质量明显更大(P<0.05),miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2组体积、质量明显更小(P<0.05)。免疫组化结果显示,对照组、NC-mimics组SATB2、nox4表达无明显差异(P>0.05),miR-182-5p-mimics组、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC组SATB2、nox4表达差异无统计学意义(P>0.05);与对照组、NC-mimics组相比,miR-182-5p-mimics组、miR-182-5p-mimics+pcDNA-NC组SATB2表达量明显降低,nox4表达量明显升高(P<0.05);miR-182-5p-mimics+pcDNA-SATB2组SATB2表达量明显上升,nox4表达量明显下降(P<0.05)。见图5、图6、表5。

表5 各组肿瘤质量、SATB2、nox4相对表达比较

图5 各组体内异种移植

图6 各组SATB2、nox4表达(免疫组化,×400)

3 讨 论

结肠癌的预后水平与患者接受诊断时的分期、淋巴结转移及远处转移关系密切,早期结肠癌患者的生存率相对较高,而出现转移患者的生存率明显降低〔11〕。结肠癌细胞通过迁移和增殖完成转移和扩散,是导致患者接受治疗后局部复发、病情恶化及死亡的病理基础〔12〕。miR-182-5p已被多项研究报道其在多种癌症中表达异常。王锐等〔13〕对比分析了70例结直肠癌患者与60例健康体检者的血清miRNA-182-5p表达水平,发现结直肠癌患者miRNA-182-5p表达水平上升,且miRNA-182-5p水平与疾病临床病理特征存在相关性。Yang等〔14〕研究指出,miR-182-5p在结直肠癌组织中上调,并与结直肠癌对5-氟尿嘧啶的抗性有关。本研究结果提示,高表达miR-182-5p对SW480的增殖与迁移能力有促进作用。

SATB2是一种组织特异性表达的核基质附着区结合蛋白,通过锚定核基质附着区参与转录调控和染色质重塑等过程,还能通过甲基化水平和蛋白乙酰化等途径调控基因的表达,在肿瘤转移、凋亡及免疫调节等方面均发挥着重要作用〔15〕。SATB2在结肠癌中呈低表达,其表达量下降可能与肿瘤的远处转移及患者预后情况相关〔16〕。Mezheyeuski等〔17〕对798例转移性结直肠癌患者进行了人群队列分析,发现SATB2高表达患者的预后和对化疗的反应效果较SATB2低表达患者更好。研究发现,SATB2在结肠癌中表达率较高,但表达量较正常肠黏膜组织更低,提示SATB2是一种抑癌基因〔18〕。本研究结果提示,SATB2逆转了miR-182-5p对结肠癌细胞增殖、迁移的增强作用。nox4能够促进细胞内活性氧产生,活性氧可作为第2信使促进细胞内信号通路转导,进而参与调控细胞增殖、迁移等过程〔19〕。Mroueh等〔20〕提到nox4介导产生的活性氧可防止胰腺癌细胞和结肠癌细胞中的细胞凋亡并促进肿瘤细胞生长。上皮-间充质转化是以上皮细胞极性消失及获得间质特性为主要特征,在形态学上发生成纤维细胞或间充质细胞的转化,并获得迁移转移的能力,在胚胎发育、慢性炎症、多种纤维化疾病、肿瘤侵袭转移等过程中发挥了重要作用〔21〕。E-cadherin、Vimentin可通过改变细胞间黏附作用调控癌细胞迁移、侵袭能力〔22〕,Wang等〔23〕研究表明,SATB2蛋白表达与上皮-间充质转化过程存在相关性,与E-cadherin表达呈正相关,而与Vimentin表达呈负相关。本研究结果与徐纪中等〔24〕的研究结果一致。

综上,miR-182-5p对结肠癌细胞的增殖和迁移能力具有促进作用,能够降低SATB2表达并影响SATB2/nox4信号通路及其相关蛋白,SATB2能够反向调控miR-182-5p表达。