黄芩苷调控PI3K/Akt通路对过氧化氢诱导的内皮祖细胞损伤的保护作用

吴钦钦 孙珊 严凤琴 卜晓芬 朱虹

(武汉市中心医院全科医学科,湖北 武汉 437000)

据报道,全世界死亡和残疾的主要原因应该是非传染性疾病和心血管疾病〔1〕。急性心肌梗死(AMI)是一种常见的、死亡率最高的心血管疾病〔2〕。因此,预防和治疗这种疾病显得尤为重要。内皮祖细胞(EPCs)扎根于骨髓,具有强大的增殖能力,被认为是血管生成过程中的主要效应细胞。血管损伤或缺血可刺激骨髓源性EPCs的动员和迁移,使其归位到相应的靶器官〔3〕。EPCs不仅能融入受损血管,分化为成熟内皮细胞,还能通过旁分泌法修复血管内皮,减轻心脏重构的影响,参与心肌缺血、梗死的恢复过程〔4〕。AMI患者的EPCs常存在动员率低、靶向性差、损伤等问题〔5〕。研究〔6〕显示,过氧化氢(H2O2)增加了体内活性氧(ROS)的积累,而ROS无法被细胞清除,导致氧化应激损伤和EPCs代谢受损。因此,探索一种新的机制来改善EPCs的功能至关重要。黄芩苷(5,6,7三羟基黄酮7-b-D葡萄糖醛酸)是从黄芩根中分离得到的主要成分,具有多种药理活性,如抗炎、抗肿瘤、免疫调节等〔7〕。有研究〔8〕报道,黄芩苷具有强大的抗氧化活性,可抑制博莱霉素诱导的大鼠成纤维细胞凋亡,并阻止ROS的产生。黄芩苷可降低血管内黏附因子水平和动脉粥样硬化斑块的生成〔9〕。既往研究〔10,11〕发现,黄芩苷通过降低细胞凋亡对缺氧复氧诱导的肺动脉内皮细胞和凝血酶刺激的人脐静脉内皮细胞均有血管保护作用。然而,黄芩苷作用于EPCs的潜在机制仍未被探索。相关文献〔12〕表明,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的激活对内皮功能障碍和细胞凋亡具有保护作用。本研究探讨黄芩苷对H2O2诱导的EPCs损伤的保护作用及其作用与PI3K/Akt通路的调控关系。

1 材料与方法

1.1实验动物 动物实验均经医院动物伦理委员会批准。4月龄,平均体质量(200±10)g的健康成年SD大鼠购自广东省实验动物监测所,许可证号：SYXK(粤)2021-0122。所有大鼠饲养在22 ℃和50%湿度的条件下,饮食正常。

1.2主要试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水(PBS)、碱性成纤维细胞生长因子、多聚甲醛购自上海碧云天生物公司;M199培养基、胎牛血清和1%青霉素-链霉素购自美国Gibco公司;血管内皮生长因子(VEGF)购自美国Thermo Fisher公司;1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基林碳菁标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)、甘露醇购自索莱宝生物公司;异硫氰酸荧光素凝集素(FITC-UEA)-1购自德国默克公司;H2O2、黄芩苷(纯度95%)、Hoechst33258购自Sigma Aldrich公司;PI3K抑制剂LY294002、噻唑蓝(MTT)试剂盒购自英国Abcam公司;胱天蛋白酶(Caspase)-3荧光检测试剂盒购自Clontech公司;ROS检测试剂盒(型号：LIVE绿色)购自美国Invitrogen公司;乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和GAPDH一抗及山羊抗兔二或山羊抗鼠二抗购自英国Abcam公司。

BX53M光学显微镜、IX73荧光显微镜购自日本奥林巴斯;SpectraMax5多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司;DxFLEX流式细胞分析仪和CytExpert软件购自美国Beckman公司。

1.3EPCs细胞的分离与鉴定 SD大鼠用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后颈椎脱臼安乐死,然后用PBS冲洗骨髓腔,直至洗涤液无色透明。骨髓腔灌洗液收集于15 ml离心管中并离心。取上清液和脂肪,用5 ml PBS重悬细胞。取5 ml淋巴细胞分离液和制备好的细胞悬液加入新的15 ml离心管中。密度梯度离心获得单个核细胞,并将其接种到6孔板中,板上涂有纤维连接蛋白。采用含20%胎牛血清、5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/ml VEGF、1%青霉素-链霉素的M199培养基培养细胞。

用100倍光学显微镜观察细胞培养4、8、14 d后细胞形态的变化。让EPCs细胞在体外分化生长2 w,达到70%融合。然后将Dil-ac-LDL用培养液稀释至30 μg/ml,加入细胞中,在37 ℃培养箱中培养4 h。PBS洗涤2次后,用4%多聚甲醛固定EPCs细胞15 min,然后加入400 μl 10 μg/ml的FITC-UEA-1于37 ℃培养箱中孵育1 h。用200倍的荧光显微镜观察染色结果。

1.4EPCs细胞分组 根据以往的研究报道〔13〕建立EPCs细胞损伤模型：当EPCs融合度在80%左右时,用无血清低糖DMEM培养基饥饿细胞至少12 h,使细胞在静止期同步生长。24 h后,细胞培养在37 ℃,5% CO2,500 μmol/L H2O2培养基中,依据文献〔14〕将EPCs细胞随机分为对照组、H2O2组;为了探讨黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞损伤,通过参考文献〔15〕和预实验设置黄芩苷低、中、高剂量组(分别用30、60、120 μg/ml黄芩苷预处理细胞24 h,再用500 μmol/L H2O2培养基培养24 h);为了明确PI3K/Akt通路与H2O2诱导的EPCs细胞损伤的关系,在黄芩苷高剂量组的基础上设置黄芩苷高剂量+LY294002组(120 μg/ml黄芩苷和10 μmol/L LY294002〔16〕分别预处理细胞24 h和1 h,再用500 μmol/L H2O2培养基培养24 h)。

1.5MTT检测EPCs细胞活力 EPCs细胞(1×105)接种在96孔板,每孔加入50 μl无血清培养基和50 μl MTT试剂。96孔板置于培养箱中培养3 h。随后,除去MTT试剂-培养基混合物,每孔加入150 μl MTT溶剂,然后轻柔振荡15 min。在590 nm处用多功能酶标仪检测吸光度,并通过计算处理组与对照组的吸光度百分比来表达细胞活力。

1.6Hoechst33258核染色评价EPCs细胞凋亡 凋亡细胞最显著的变化是染色体浓缩。Hoechst33258可作为荧光探针与DNA分子结合。在凋亡细胞中,Hoechst33258的摄入量增加,凋亡细胞显示出强烈的蓝色荧光。经过1.4处理后,将EPCs细胞用4%多聚甲醛在0.1 mol/L PBS(pH7.4)中4 ℃固定10 min,然后用PBS洗涤5次。用5 mg/ml Hoechst33258染色10 min后,荧光显微镜观察各组EPCs细胞凋亡情况。

1.7Caspase-3荧光检测试剂盒检测EPCs细胞Caspase-3的活性 将1.4中EPCs细胞裂解并离心。然后,将收集的上清液与5 μl的Caspase-3荧光底物(DEVD-AFC)孵育1 h。最后,通过使用FL600荧光阅读器测量荧光强度来评估Caspase-3活性。

1.8管形成实验检测EPCs细胞管形成能力 预冷的基质胶与无血清培养基混合,然后用该混合物涂布24孔板。将培养皿置于37 ℃培养箱中30 min,使基质胶凝固。1.4中EPCs细胞以每孔2×104的剂量加入培养皿中,孵育24 h。倒置显微镜拍照。

1.9试剂盒检测EPCs细胞内氧化损伤标志物水平 将EPCs细胞(1×105细胞/ml)置于6孔板中18 h,并按1.4中方法处理。取适量上清液,按生产厂家说明书测定LDH、MDA、SOD水平。

ROS检测试剂盒检测EPCs细胞内ROS水平：EPCs细胞与含10 μmol 2,7二氯二氢荧光素二醋酸酯(H2DCF-DA)的M199共孵育30 min,然后用PBS洗涤。结果采用流式细胞仪分析。

1.10Western印迹检测EPCs细胞内凋亡、PI3K/Akt通路相关蛋白表达 使用RIPA缓冲液、蛋白酶抑制剂和苯甲基磺酰氟收集蛋白质,用蛋白质定量试剂盒定量,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。然后,通过电泳将蛋白质转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂奶粉封闭膜1 h,然后与Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、PI3K(1∶500)、p-PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶500)、p-Akt(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗体孵育。孵育24 h后,用1% Tris缓冲盐水和Tween20冲洗膜,用山羊抗兔二抗(1∶10 000)或山羊抗鼠二抗(1∶10 000)孵育。使用电化学发光(ECL)试剂盒和凝胶成像系统显示蛋白条带。使用ImageJ对结果进行分析。

1.11统计学分析 采用SPSS20.0软件进行分析。组间比较采用单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1骨髓衍生EPCs的鉴定 EPCs培养4 d后呈圆形或椭圆形,培养8 d后呈梭形或圆形,培养2 w后呈鹅卵石状,见图1。Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1阳性表达的细胞被鉴定为分化的EPCs,见图2。

图1 来源于骨髓的内皮祖细胞形态(×400)

图2 Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色鉴定EPCs(×200)

2.2黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞增殖、凋亡的影响 与对照组比较,H2O2组EPCs细胞活力显著下降,凋亡率显著上升(P<0.05);与H2O2组比较,黄芩苷低、中、高剂量组EPCs细胞活力显著升高,凋亡率显著降低,且呈剂量依赖性(P<0.05);与黄芩苷高剂量组比较,黄芩苷高剂量+LY294002组EPCs细胞活力显著降低,凋亡率显著升高(P<0.05),见图3、表1。

表1 黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞管形成及细胞中氧化损伤标志物的影响

图3 黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞凋亡的影响(Hoechst33258染色,×200)

2.3黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞中氧化损伤标志物的影响 与对照组相比,H2O2组EPCs细胞中LDH、ROS、MDA水平显著升高,SOD水平显著降低(P<0.05);与H2O2组相比,黄芩苷低、中、高剂量组LDH、ROS、MDA水平显著下降,SOD水平显著上升,且呈明显剂量依赖性(P<0.05);与黄芩苷高剂量组相比,黄芩苷高剂量+LY294002组LDH、ROS、MDA水平显著上升,SOD水平显著下降(P<0.05),见表1。

2.4黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞管形成的影响 H2O2组EPCs细胞的相对分支点数明显低于对照组(P<0.05);黄芩苷低、中、高剂量组相对分支点数依次高于H2O2组(P<0.05);黄芩苷高剂量+LY294002组相对分支点数显著低于黄芩苷高剂量组(P<0.05),见表1、图4。

图4 黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞管形成的影响(×100)

2.5黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞中凋亡相关蛋白的影响 与对照组相比,H2O2组EPCs细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达及相对Caspase-3活性明显增高,Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显降低(P<0.05);与H2O2组相比,黄芩苷低、中、高剂量组EPCs细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达及相对Caspase-3活性呈明显剂量依赖性下降,Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值呈明显剂量依赖升高(P<0.05);与黄芩苷高剂量组相比,黄芩苷高剂量+LY294002组EPCs细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达及相对Caspase-3活性明显升高,Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显降低(P<0.05),见表2、图5。

表2 黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞相关凋亡蛋白及PI3K/AKT通路蛋白表达的影响

1～6：对照组、H2O2组、黄芩苷低、中、高剂量组、黄芩苷高剂量+LY294002组图5 黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞中凋亡相关蛋白的影响

2.6黄芩苷对H2O2诱导的EPCs细胞中PI3K/akt通路蛋白表达的影响 与对照组比较,H2O2组EPCs细胞中p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt比值均显著下降(P<0.05);与H2O2组相比,黄芩苷低、中、高剂量组p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt比值依次明显上升(P<0.05);与黄芩苷高剂量组相比,黄芩苷高剂量+LY294002组p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt比值明显降低(P<0.05),见表2、图5。

3 讨 论

血管内皮细胞损伤被认为是动脉疾病级联的第一步,一直被认为是冠心病发展的关键〔17〕。EPCs作为骨髓源性祖细胞,具有很强的增殖能力,被认为是血管生成过程中的主要效应细胞。血管损伤或缺血可刺激骨髓源性EPCs动员、迁移和归巢〔3〕。有研究〔18,19〕表明,EPC移植是治疗AMI安全有效的方法,但氧化应激会导致移植早期大量EPCs死亡,从而削弱治疗效果。因此,改善氧化应激下EPCs的生物学功能,促进AMI后心肌修复至关重要。

研究〔20〕表明,为了修复局部不可修复的损伤,EPCs必须首先从骨髓动员进入外周循环,然后再到损伤处分化为血管内皮细胞。大鼠的EPCs一般来源于外周血、骨髓和脾脏。由于骨髓中EPCs的数量最多,本研究从股骨和胫骨骨髓腔中分离并培养了干细胞。细胞培养2 w后,细胞呈鹅卵石样形态,这与研究〔21〕结果一致。有研究〔22〕表明,H2O2诱导的内皮细胞凋亡与ROS产生之间存在联系。本研究发现,H2O2会引发EPCs的氧化应激。

相关证据〔7〕表明,黄芩苷参与多种调节功能,包括细胞凋亡和抗氧化应激调控。黄芩苷通过减少细胞凋亡对缺氧/脱氧暴露的人动脉内皮细胞具有血管保护作用〔23〕。此外,黄芩苷可通过激活小鼠脑微血管内皮细胞中Nrf2介导的抗氧化应激通路,保护脂多糖诱导的血脑屏障损伤〔24〕。有研究〔25〕表明,黄芩苷可以通过抗氧化机制保护内皮细胞免受三氧化二砷诱导的细胞毒性作用。本研究提示,黄芩苷对H2O2处理的EPCs具有保护作用。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡分子Bax和抗凋亡分子Bcl-2,已被证实参与调节凋亡通路。Caspase-3由Bcl-2激活,其上调表达可加速细胞凋亡〔16〕。本研究提示,黄芩苷通过抑制促凋亡蛋白的表达降低EPCs细胞的凋亡能力,进而缓解细胞损伤。有研究〔26〕表明,血管形成与EPCs功能有关,H2O2情况下,血管形成能力减弱,EPCs功能受损。本研究结果说明,黄芩苷能够提高H2O2诱导的EPCs血管形成能力。

研究〔8〕表明,黄芩苷通过PI3K/Akt通路发挥抗氧化作用。PI3K/Akt通路的激活促进了EPCs的增殖、转移和血管修复能力〔27〕。miR-126通过激活PI3K/Akt途径恢复H2O2处理的EPCs的功能〔26〕。本研究结果表明,黄芩苷恢复了H2O2降低的p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt的比值。推测黄芩苷可能通过PI3K/Akt通路在H2O2处理的EPCs中发挥调控作用。进一步研究表明,LY294002阻碍了黄芩苷对H2O2诱导的EPCs PI3K/Akt通路相关蛋白表达、细胞活力、细胞凋亡、血管形成、LDH和ROS生成等功能恢复的作用,提示黄芩苷通过PI3K/Akt通路减轻H2O2对EPCs的调控作用。

综上,黄芩苷通过恢复PI3K/Akt通路改善H2O2环境下EPCs的氧化损伤。然而,黄芩苷还被发现具有抗炎药理活性〔7〕。接下来将进行进一步的实验来探索黄芩苷在H2O2诱导的EPCs中的抗炎作用。此外,有研究〔28〕表明,内皮细胞损伤可追溯到H2O2引起的血管再生障碍与Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖体S6蛋白激酶(p70S6K)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的改变。但本研究为初步研究,后续将通过影响其他信号通路,改善EPCs的分离培养,继续探讨黄芩苷对培养大鼠EPCs功能的影响。