基于PI3K/Akt信号通路探究下调miR-221对肝癌大鼠的干预效果

代宇 范伟

(贵州省人民医院肝胆外科,贵州 贵阳 550002)

肝癌的发生与缺乏微量元素、肝硬化、生活环境、吸烟、遗传等因素存在联系,其早期临床症状表现为刺痛、腹泻、腹水、食欲减退、肝大、恶性等。目前临床多通过免疫治疗、抗病毒治疗、局部消融、手术等方法对肝癌进行治疗,但其复发率仍较高,因此寻找新的治疗策略对肝癌患者预后具有重要意义〔1～6〕。miR-221在宫颈癌、喉癌、甲状腺癌等多种恶性肿瘤中均呈高表达,可参与肿瘤的发生、发展〔7〕。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)在鼻咽癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌等多种肿瘤中发挥抗凋亡、促增殖的作用〔8〕。基于此,本文基于PI3K/Akt信号通路探究下调miR-221对肝癌大鼠的干预效果,为肝癌的诊治提供参考。

1 对象与方法

1.1研究动物 选取43只SPF级Wistar大鼠,体质量160～200 g,由珠海市丽珠单抗生物技术有限公司提供,动物许可证号：SYXK(粤)2021-0158,所有大鼠在室温23 ℃、湿度50%的无菌笼子中喂养7 d,本试验操作均参照动物试验伦理要求的相关规定,且经医院伦理委员会批准同意。

1.2miR-221慢病毒载体构建 采用GenBanK查找序列,获得脂蛋白脂肪酶(LPL)基因序列,构建miR-221沉默、过表达转染质粒,由长沙爱科博生物科技有限公司设计并合成,并设置病毒滴度为1×109TU/ml,测定慢病毒滴度。

1.3分组与建模 选取10只大鼠作为空白组,其余33只参照王军等〔9〕建立模型,将0.5 ml/100 g的二乙基亚硝胺注射入大鼠腹腔内,2次/w,连续注射4 w,以大鼠出现精神萎靡、被毛蓬松污秽、眼睛无神、拱背等情况为建模成功,最终有30只建模成功,分为模型组、上调组、下调组各10只。

1.4miR-221转染 上调组、下调组分别注射10 μl miR-221过表达、沉默慢病毒悬液,空白组、模型组注射同剂量的生理盐水,注射7 d后观察大鼠变化。

1.5病理学观察 miR-221转染后,麻醉后处死大鼠,获取肝脏组织,进行脱水、石蜡包埋处理,进行苏木素-伊红(HE)染色,光镜下,对病理形态进行观察。

1.6miR-221转染效率鉴定 实时荧光定量法鉴定miR-221转染效率,提取肝脏组织总RNA,采用聚合酶链反应(PCR)法鉴定miR-221表达量,使用Primer5.0设计引物序列,反应体系：20 μl蒸馏水,模板DNA 1 μl、0.5 μl上下游引物。反应条件：95 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min、50 ℃ 2 min,60 ℃ 30 s,共进行45个循环,采用2-△△Ct方法计算出miR-221的表达量。

1.7生长因子、血清癌胚抗原(CEA)、血清甲胎蛋白(AFP)水平检测 取各组大鼠肝脏组织,放入离心管,将放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、蛋白酶抑制剂加入,以12 000 r/min离心处理10 min,制作组织匀浆,取上层清液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血管内皮生长因子(VEGF)、bFGF、CEA、AFP水平,将VEGF、bFGF、CEA、AFP标准品稀释,倒入EP管,后加入待测标准品,混匀,后将其倒入空白孔中,室温下孵育90 min,在孔中加入洗涤缓冲液,重复清洗,后加入50 μl VEGF、bFGF、CEA、AFP抗体,室温下孵育60 min,加入洗涤缓冲液,重复清洗,加入100 μl SP结合液,封孔,室温下孵育45 min,加入洗涤缓冲液,重复清洗,后加入100 μl 3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)显色液,450 nm、570 nm下测定吸光度(OD)值。

1.8PI3K/Akt信号通路蛋白相对表达量检测 采用Western印迹法检测,将各组大鼠肝脏组织放入离心管,将RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂加入,以12 000 r/min离心处理10 min,制作组织匀浆,取上层清液,使用蛋白质定量法对蛋白浓度测定,后取相同质量蛋白,进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜处理,后采用5%脱脂奶粉进行封管处理,放入4 ℃冰箱中,过夜处理,后进行清洗。加入PI3K、Akt抗体,孵育2 h,进行清洗,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗,室温下孵育3 h,凝胶成像系统下观察成像情况,计算恢复值,以GAPDH为内参,对蛋白表达情况分析。

1.9统计学处理 采用SPSS19.0软件进行配对t检验及F检验。

2 结 果

2.1病理学特征比较 如图1所示,空白组肝细胞无核分裂、细胞完整、大小一致;模型组出现炎性细胞浸润,部分肝细胞坏死;上调组炎性细胞浸润严重,细胞核出现增大;下调组炎性浸润情况明显改善,细胞大小基本恢复一致。

图1 各组肝脏组织病理特征(HE染色,×400)

2.2miR-221转染效率鉴定 如表1所示,与空白组相比,模型组、下调组、上调组miR-221表达量上升,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,上调组miR-221表达量上升,下调组miR-221表达量下降,具有统计学差异(P<0.05),说明转染成功。

表1 各组miR-221转染效率、生长因子、肿瘤标志物水平及肝脏组织PI3K/Akt信号通路蛋白相对表达量比较

2.3各组生长因子水平对比 如表1所示,与空白相比,模型组、上调组、下调组VEGF、bFGF水平上升,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,上调组VEGF、bFGF水平上升,下调组VEGF、bFGF水平下降,具有统计学差异(P<0.05)。

2.4各组肿瘤标志物水平对比 如表1所示,与空白相比,模型组、上调组、下调组CEA、AFP水平上升,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,上调组CEA、AFP水平上升,下调组CEA、AFP水平下降,具有统计学差异(P<0.05)。

2.5各组肝脏组织PI3K/Akt信号通路蛋白相对表达量 如表1、图2所示,与空白相比,模型组、上调组、下调组PI3K、Akt水平上升,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,上调组PI3K、Akt水平上升,下调组PI3K、Akt水平下降,具有统计学差异(P<0.05)。

图2 各组PI3K/Akt信号通路蛋白表达

3 讨 论

研究显示〔10〕,miR-221可参与细胞增殖、发育、细胞凋亡、脂肪代谢、造血过程、病毒防御等过程,在宫颈癌、甲状腺癌等多种恶性肿瘤中均呈高表达。在宫颈癌中,miR-221可提高HeLa细胞的增殖能力,且可使癌细胞凋亡减少;在甲状腺癌中,miR-221可促进淋巴结转移,进而促进了患者病情的发展〔11〕。焦文鹏等〔12〕研究发现,miR-221在肝癌中呈高表达,且与不良预后、肿瘤大小、临床分期存在密切联系。本研究显示,下调miR-221后可干预肝癌大鼠病情的发展,大鼠炎性浸润情况明显改善,细胞大小基本恢复一致。其机制可能为miR-221可使肝癌上皮-间质转化过程启动,且可靶向脂联素受体(AdipoR)1、植物同源结构域指蛋白(PHF)2,进而促进了肝癌细胞的激活及转移,促进肝癌患者病情的发展,因此经下调miR-221干预后大鼠病情明显改善〔13〕。

VEGF可通过改善瘤体边缘细胞能量代谢、促进微血管形成、抑制细胞凋亡等促进肿瘤的发生、发展,而肝癌的主要典型特征为大量新生血管形成,因此VEGF在肝癌患者中多呈高表达〔14〕。bFGF作为一种单链多聚体,对多种细胞的有丝分裂具有促进作用,且对血管生成具有促进作用,可参与肿瘤间质血管新生、侵袭〔15〕。CEA多由位于泌尿道、胃、呼吸道等空腔脏器肿瘤分泌,在肿瘤状态下,可进入血、淋巴循环,进而导致其水平快速升高〔16〕。AFP主要由肝细胞、卵黄囊合成,而部分肝外肿瘤、肝细胞癌、胚胎性肿瘤、卵黄囊肿瘤可重新合成AFP,进而导致AFP水平升高〔17〕。本研究表明,抑制miR-221表达,可使新生血管形成受到影响,且可促进CEA、AFP肿瘤标志物水平的优化。

PI3K/Akt是在肝癌、肾癌、胆管癌、喉癌中均呈异常表达的细胞内外信号连接桥梁〔18〕。Akt为PI3K/Akt通路重要环节,在磷酸化后可使PI3K/Akt信号通路激活,进而对下游相关基因、旁路信号分子起到了激活作用,调控了细胞迁移、侵袭、增殖、凋亡等过程,同时激活后的PI3K/Akt可促进VEGF、基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2等因子的表达,进而促进了肿瘤血管的形成、肿瘤细胞的扩散、转移,推动了肿瘤患者病情的发展〔19～21〕。本研究显示,下调miR-221可明显减少新生血管的形成,抑制病情发展,其可能作用机制为下调miR-221可抑制PI3K/Akt信号通路,作用于新生血管形成过程,进而改善了增生,最终抑制肝癌的发展。

综上所述,肝癌的发生可激活PI3K/Akt通路,使机体内VEGF、bFGF、CEA、AFP表达水平升高,促进肿瘤血管的形成,加速疾病的发展,对大鼠机体内miR-221表达量进行抑制,可抑制PI3K/Akt通路的激活,促使大鼠的恢复,表明肝癌的发病机制可能与PI3K/Akt信号通路被抑制有关。