贝那普利对C-BSA诱导膜性肾病大鼠足细胞的影响

冷琳 刘文佳 吴蔚桦 丁文飞 王玉洁 曹灵

(西南医科大学附属医院肾病内科 四川省肾脏疾病临床医学研究中心,四川 泸州 646000)

膜性肾病(MN)是全世界成人特发性肾病综合征的最常见原因。在中国过去的十年间,MN的发病率每年增加13%,已经超过了免疫球蛋白(Ig)A肾病的趋势〔1〕。阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)诱导的MN模型已在多种动物身上得到了验证〔2～4〕,其和人类MN在免疫机制上有共通之处〔3,5,6〕,但在其他机制方面还需要更多的证据。贝那普利是血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)类药物,是全球改善肾脏病预后组织(KDIGO)发布的临床实践指南中治疗特发性MN药物之一〔7,8〕。ACEI可降低血压和蛋白尿,预防肾脏纤维化,减缓肾病患者肾功能下降,但其肾脏保护作用的具体机制尚未被完全阐明。足细胞凋亡是MN的重要发病机制之一。足细胞病变中机械压力或生物力学应变可导致血管紧张素(Ang)Ⅱ过表达,增加转化生长因子(TGF)-β的表达及活性〔9〕,通过TGF-β1-P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、TGF-β1-Smads等多种信号通路,使足细胞凋亡、脱落、上皮-间充质转化等,启动肾小球硬化的发展〔10〕。本研究探讨贝那普利对C-BSA诱导MN大鼠足细胞的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级、体质量(140±20)g的雄性SD大鼠24只,由西南医科大学实验动物中心〔动物许可证号：SCXK(川)2015-030〕提供,西南医科大学实验动物伦理委员会批准(动物伦理编号20190100006)。

1.2试剂与仪器 贝那普利购自北京诺华制药;AngⅡ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海桥社;免疫组化检测试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、TGF-β1多克隆抗体、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2单克隆抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体购自北京中杉金桥,p38MAPK多克隆抗体、肾母细胞瘤悼蛋白(WT)1多克隆抗体购自巴傲得生物科技有限公司,兔抗鼠IgG抗体购自北京Bioss公司;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物。光学显微镜和荧光显微镜为日本Olympus;图像分析软件来自美国伯乐。

1.3实验动物模型建立 将24只雄性SD大鼠适应性喂养1 w后随机分为正常对照组、模型组、贝那普利干预组、贝那普利对照组,每组6只。正常对照组、贝那普利对照组不预免疫、不造模,模型组、贝那普利干预组参照改良Border方法制作大鼠MN模型〔4〕,预免疫1 w后开始正式免疫,每只大鼠隔日尾静脉注射C-BSA(20 mg/kg),连续4 w,检测动物尿蛋白均>40 mg/24 h,初步判定造模成功。自正式免疫起,模型组、贝那普利干预组每日予以贝那普利(10 mg/kg)灌胃,而正常对照组、贝那普利对照组每日予以1 ml生理盐水代替,连续6 w。正式免疫后第5周末收集24 h尿液。各组大鼠于正式免疫后第6周末杀检,收集肾脏和血清。

1.4血清指标检测 尿标本和血标本于西南医科大学附属医院检验科,用全自动生化仪行血清白蛋白(Alb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)检测,免疫散射速率比浊法测定24 h尿蛋白浓度(24 h UTP)。

1.5观察肾脏病理改变 用4%多聚甲醛固定肾组织,脱水、透明并浸蜡,制成2 μm厚的石蜡切片。常规苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸六胺银(PASM)染色和Masson染色观察肾脏病理改变。

1.6TUNEL法检测肾组织细胞凋亡 常规对5 μm石蜡切片进行脱蜡和胃蛋白酶消化。在清洁和干燥切片后,将TUNEL检测液滴添加到切片中,并将切片在37 ℃下无光培养60 min。然后将过氧化物酶标记的抗地高辛抗体滴在切片上反应30 min。DAB显色、HE染色后,立即用蒸馏水冲洗,脱水,透明中性胶封。结果在光学显微镜下进行观察和拍照。如果细胞核呈棕黄色或棕褐色,则为阳性结果。在高倍(×400)视野下,在每个切片中随机观察到10个非重复和非硬化的肾小球。计算单个肾小球中TUNEL阳性细胞的比例(阳性细胞数/有核细胞总数)作为肾小球凋亡指数(AI)。

1.7ELISA测定肾组织匀浆AngⅡ含量 取-80 ℃保存的肾组织4 ℃解冻后切块。匀浆后加入1.0 ml磷酸盐缓冲液(PBS),15 000 r/min离心20 min,取上清,按试剂盒说明书操作。在酶标仪上读取每孔450 nm波长下的OD值,根据样品的OD值计算样品的浓度。

1.8免疫组化法检测肾组织TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT1蛋白表达 大鼠肾组织经固定、脱水、透明、石蜡包埋后,5 μm连续切片,60 ℃烤片,经脱蜡、水化、抗原修复后滴加一抗,4 ℃孵育过夜后加入二抗孵育,DAB室温显色。流水冲洗后苏木素复染,1%稀盐酸分化,饱和碳酸锂返蓝。上述切片用脱水、透明和中性胶密封,并在光学显微镜下观察和拍摄结果。采用Image-pro plus6.0病理彩色图像分析处理系统对结果行半定量分析。

1.9统计学处理 采用SPSS13.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1各组24 h UTP及血清指标比较 正常对照组、贝那普利对照组24 h UTP无明显差别(P>0.05);与正常对照组相比,模型组、贝非普利干预组24 h UTP、BUN、Scr水平明显增加、Alb水平明显下降(P<0.05);与模型组相比,贝那普利干预组Alb、Scr水平明显升高(P<0.05),见表1。

表1 各组24 h UTP、Alb、Scr、BUN水平及AI比较

2.2肾形态学观察结果 正常对照组、贝那普利对照组肾组织无病理形态学改变。模型组、贝那普利干预组HE染色可见肾小球明显肿大,肾小球基底膜(GBM)弥漫增厚,毛细血管袢受压,管腔狭窄甚至闭塞,球囊腔狭窄甚至粘连,系膜细胞和基质增生,部分肾小管上皮细胞肿胀,肾间质胶原纤维明显沉积,严重纤维化;Masson染色显示,系膜区和肾间质蓝色阳性物质增多,系膜区和肾间质增宽;PASM染色显示肾小球基底膜弥漫性增厚,部分肾小球出现典型的“钉突”形成和“假双轨”征。贝那普利干预组病理损害程度较模型组有所减轻,见图1。

图1 各组肾组织病理形态(×400)

2.3肾组织中TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1的表达情况 第6周末正常对照组、贝那普利对照组在肾小球脏层分布区域可见TGF-β1、P38MAPK、Bax少量表达,Bcl-2、WT-1有较多表达。正常对照组、贝那普利对照组肾小球TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1表达无明显差异(P>0.05)。与正常对照组相比,模型组和贝那普利干预组肾小球TGF-β1、P38MAPK、Bax表达明显增加,Bcl-2、WT-1表达明显减少(均P<0.05);与模型组相比,贝那普利干预组肾小球TGF-β1、P38MAPK、Bax表达明显减少,Bcl-2、WT-1表达明显增加(均P<0.05),见图2、表2。

图2 各组肾组织TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1表达(免疫组化染色,×400)

表2 各组肾组织匀浆AngⅡ含量、肾组织TGF-β1、P38MAPK、Bax、Bcl-2、WT-1表达

2.4各组肾组织匀浆中AngⅡ含量的变化 正常对照组、贝那普利对照组肾组织匀浆中有AngⅡ表达,表达无明显差异(P>0.05)。模型组、贝那普利干预组肾组织匀浆中AngⅡ含量上升。与正常对照组相比,模型组、贝那普利干预组AngⅡ含量均明显增加(P<0.05);与模型组相比,贝那普利干预组AngⅡ含量明显减少(P<0.05),见表2。

2.5肾组织中细胞凋亡的动态变化 TUNEL染色结果显示正常对照组、贝那普利对照组肾小球未见细胞凋亡,肾小球AI无明显差异(P>0.05);模型组、贝那普利干预组肾小球脏层区域可见凋亡细胞明显增多,见图3。与正常对照组相比,模型组、贝那普利干预组肾小球AI均明显增加(P<0.01);与模型组相比,贝那普利干预组各肾小球AI明显减少(P<0.05),见表1。

图3 各组肾小球细胞(TUNEL染色,×400)

3 讨 论

MN是成人肾病综合征的常见病因〔11〕,常常表现为大量蛋白尿,临床可以体现为肾病综合征。一个理想的模型将有助于了解MN的发病机制,从而提高诊断和治疗。早在20世纪有学者发现C-BSA免疫的兔产生了IgG和C3的上皮下沉积,提出了抗原电荷可能是上皮下沉积形成的关键因素〔2〕。有研究发现,在双转基因的C-BSA诱发肾病的小鼠中,Th2 细胞与高胆固醇血症和蛋白尿显著相关〔3〕。同时在MN 患者中,Th17细胞因子刺激产生的炎症与MN患者血栓形成与复发密切相关〔6〕。Debiec等〔5〕在MN患者上皮下免疫沉积物中发现牛血清白蛋白,表明C-BSA与带负电荷的肾小球毛细血管壁结合,随后形成原位免疫复合物,C-BSA可能是儿童MN的主要致病靶点之一。因此,C-BSA 诱导的MN 模型可以较好地模拟人类MN 的发病机制,而不同的C-BSA剂量在其中至关重要。根据本课题组前期研究中采用改良Border方法,使用低中高不同剂量C-BSA,发现高剂量组能更好地表现MN病理特点〔4〕。本实验参照改良Border方法用大剂量C-BSA成功构建MN模型,与前期研究相一致。

AngⅡ具有促血管收缩、肾小管水钠重吸收及细胞增殖等重要生理功能,是肾素-Ang系统的重要组成成分。早期即有报道指出,在MN病人肾脏组织中发现AngⅡ过表达,且可能参与TGF-β的上调〔12〕。亦有报道指出,在5/6肾切除术大鼠模型中,随着肾组织中AngⅡ生成的减少,TGF-β1 mRNA表达量也随之减少〔13〕。目前较多研究表明,TGF-β1信号传导是各种足细胞损伤的关键介体,而P38MAPK是其信号通路的枢纽,TGF-β1可调控P38MAPK导致肾脏的病理损伤。已有研究证实,TGF-β1可能是糖尿病肾病进展的关键因素,在体内外实验中,咪唑聚酰胺类化合物(PI)靶向TGF-β1治疗可促进系膜细胞生长,改善足细胞损伤,改善肾小球和间质变性〔14〕。本实验说明,C-BSA诱导MN模型与人类MN在除了免疫方面以外的其他机制上也有一定的相似之处,为其模拟人MN可靠性提供了更多的实验依据。

贝那普利是临床常用的ACEI类降血压药物。大量研究显示〔15～17〕,除通过血流动力学发挥作用外,ACEI还可通过抗凋亡、抗氧化应激、抗炎症、抗纤维化等机制发挥作用,但ACEI类药物在MN中具体的作用靶点尚不完全清楚,因此确定ACEI发挥肾脏保护作用的可能机制对于深入了解MN的治疗是十分必要的。贝那普利可降低DN大鼠及高糖诱导的RMCs中NF-κB、TGF-β、TRPC6水平,抑制高糖诱导的RMCs凋亡,改善DN大鼠肾功能,减轻肾脏损伤〔18〕。ACEI抑制AngⅡ的产生,降低TGF-β的表达和明显炎症反应的发生,从而抑制IL-33/sST2减少风湿性心脏病纤维化的进展〔19〕,也可能通过激活核因子E2相关因子(Nrf2)的表达或抑制活性氧(ROS)介导的氧化应激对NOX4的反应发挥抗肝纤维化作用〔20〕。在狼疮小鼠模型中,卡托普利可降低脑、脾和肾Ⅰ型干扰素应答基因的表达,降低循环和组织干扰素-α水平,降低小胶质细胞活化和减少抑郁样行为,还能降低血浆中的自身抗体水平及肾和脑中的免疫复合物沉积发挥治疗作用〔21〕。本研究结果表明,贝那普利很可能通过抗足细胞凋亡对MN大鼠肾脏发挥保护作用,再次证明了贝那普利预防或治疗MN的潜力。

贝那普利可抑制AngⅡ的经典生成途径,推测贝那普利可能通过减少AngⅡ生成来抑制TGF-β1相关信号通路发挥作用。在糖尿病大鼠模型中证实使用AT1R拮抗剂能有效地降低肾小球TGF-β1的生成量〔22〕。本研究结果表明,贝那普利很可能通过减少AngⅡ,进而抑制TGF-β1/P38MAPK信号通路对MN肾脏发挥保护作用。但有研究发现,在糖尿病肾病小鼠中,缺乏Ca2+结合蛋白Swiprosin-1可激活TGF-β1/P38MAPK信号通路,从而降低线粒体依赖途径导致的足细胞凋亡,同时在体外高糖诱导的MPC-5足细胞中P38MAPK靶向敲低后,细胞凋亡增加〔23〕。因此,TGF-β1/P38MAPK信号通路在不同条件影响下与足细胞凋亡的关系还需要进一步研究。

综上,C-BSA诱导的MN大鼠与人MN在免疫方面以外的其他发病机制上具有一定的相似之处,为构建和完善理想的MN实验模型增加了更多的实验基础。贝那普利可以减轻C-BSA诱导的MN大鼠足细胞损伤,发挥肾脏保护作用,其机制与抑制TGF-β1/P38MAPK信号通路活性有关,这为研究ACEI类药物对MN治疗机制提供了更多的实验依据。ACEI类药物在临床应用于许多疾病的治疗,但其作用机制有待深入研究。