基于肠道菌群结构特征及5-HT探究枳术汤改善功能性便秘大鼠肠道传输功能的作用机制

姚玉乔 徐龙剑 杨俊 胡明德 杨沛月 许淑珍

(江西中医药大学 1附属医院肛肠科,江西 南昌 330006;2研究学院)

功能性便秘是胃肠道功能障碍性疾病的常见疾病,肠道菌群失衡是功能性便秘发生的重要病因〔1,2〕。目前功能性便秘治疗手段以纠正菌群紊乱为主,调整肠道内各种菌属平衡状态对防治功能性便秘具有关键意义。虽然粪便移植、益生菌等治疗功能性便秘,取得了一定疗效〔3～5〕,但是上述治疗手段均存在理论风险,如益生菌过度使用引起的全身性感染〔6〕、易感个体的过度免疫刺激〔7〕等副作用。中医药治疗便秘,具有副作用小、疗效可观、患者依从性强等优势,可以作为未来研究和治疗功能性便秘的重要方向。本研究通过观察枳术汤对功能性便秘大鼠疗效,初步探讨肠道菌群及5-羟色胺(HT)对肠道传输功能的影响作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD大鼠16只,雌雄各半,平均体质量(165±15)g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号SCXK(湘)2019-0004,本研究通过了动物伦理委员会批准,符合人类的道德伦理标准和国际惯例符合伦理要求。

1.2药物、试剂与仪器 主要药物：复方地芬诺酯片(批号：2104018,厂家：常州康普药业有限公司,批准文号：国药准字H32022716)。莫沙比利片(批号：26210312,厂家：鲁南贝特制药有限公司,批准文号：国药准字H19990317)。枳术汤：3.03 g/10 g白术颗粒剂、1.16 g/10 g炒枳实颗粒剂以150 ml沸水冲泡。复方地芬诺酯混悬液：取复方地芬诺酯片250 mg打磨成细粉,加入165 ml纯水配制成浓度为1.5 mg/ml的复方地芬诺酯混悬液。莫沙比利剂：取1片莫沙比利片5 mg,打磨成细粉,再加入20 ml纯水配制成浓度为0.25 mg/ml的莫沙比利剂。主要试剂：DNA提取试剂盒(厂家：Promega公司,批号：LS5247)和聚合酶链反应(PCR)试剂盒(厂家：Promega公司,批号：B202138)。5-HT试剂盒(厂家：上海西唐生物技术有限公司,批号：12207331。主要仪器：高速离心机属德国Eppendorf公司产品,电泳仪和凝胶成像系统属美国Bio-Rad公司产品。

1.3功能性便秘模型建立 取12只大鼠分为对照组、模型组、莫沙必利组和枳术汤组,每组4只,雌雄各半,参照文献动方法〔8〕,通过灌胃15 mg/ml复方地芬诺酯混悬液(10 ml/kg)建立功能性便秘模型。另取4只大鼠为对照组,雌雄各半,灌胃同等体积纯水。7 d为1个疗程,每个疗程间暂停1 d。总共灌胃56次,即8个疗程。饲养条件：湿度40%～70%,温度25 ℃。

1.4实验给药 建立模型成功后,枳术汤组灌服枳术汤(10 ml/kg),莫沙比利组灌服莫沙比利剂(2.5 mg/kg),模型组和对照组灌胃等体积生理盐水,2次/d,连续7 d。

1.5大鼠胃肠排空时间及粪便含水率检测 末次给药后,禁食不禁水12 h,经口灌服3 ml活性炭混悬液,记录灌服活性炭混悬液结束时间和第1粒黑便排除时间,计算各组胃肠排空时间(胃肠排空时间=第1粒黑便排除时间-灌服活性炭混悬液结束时间)。称取第1粒黑便重量为湿重,置入干燥箱烘干后,再次称取粪便重量为干重,计算粪便含水率〔粪便含水率=(湿重-干重)/湿重×100%〕。

1.6结肠肌电的检测 观察大鼠排便结束后,所有大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(4 ml/kg)进行麻醉,固定大鼠四肢,剪除腹部皮毛,暴露皮肤,进行消毒后沿腹正中线切开,钝性分离充分暴露大鼠结肠段。用一次性采血针头作套针穿刺肠壁浆肌层,将导线的裸露段银丝埋藏于肌层里作为其中一根电极。距该电极1 cm处(结肠段),使用同样操作方式插入另一根电极,连接两根电极于Power Lab的生物电记录仪上,记录大鼠结肠肌电振幅和频率的变化。

1.7大鼠肠道菌群分析 取大鼠大便于实验管中,加入DNA提取试剂盒来提取DNA。取提取的DNA作为目标基因,稀释后取2.5 ng作为模板,利用带有Barcode的16 S V4通用引物(515F-806R) 进行PCR。计算肠道菌群的菌门相对分度,分析大鼠肠道菌群结果特征。

1.8大鼠血清5-HT含量测定 结肠肌电检测实验结束后,采集腹主静脉集血液5 ml,离心机离心后取上层清液,根据酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒说明书,利用ELISA测定血清5-HT含量。

1.9Western印迹检测蛋白相对表达量 处死大鼠后,迅速分离各组大鼠结肠组织,清洗滤干后加入10%甲醛固定,用放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液裂解组织,10 000 r/min离心10 min,取上清液,提取总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白纯度,吸取50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转膜,将分离的蛋白电转移至聚偏氟乙烯膜上。加入封闭液,室温条件下封闭1 h,加入5-HT3R抗体(1∶1 000)、5-HT4R抗体(1∶1 000)及GAPDH抗体(1∶1 000),4 ℃过夜孵育。利用磷酸盐缓冲液充分洗膜,加入二抗(1∶2 000),室温孵育1 h。利用凝胶成像仪检测灰度值。

1.10统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析,两两比较行LSD-t检验。

2 结 果

2.1枳术汤对大鼠胃肠排空时间及粪便含水率的影响 与对照组比较,模型组、莫沙必利组和枳术汤组胃肠排空时间明显延长,粪便含水率明显降低(均P<0.05);与模型组比较,莫沙必利组和枳术汤组胃肠排空时间明显缩短,粪便含水率明显降低(均P<0.05)。见表1。

表1 各组胃肠排空时间、粪便含水率、肌电频率和振幅、血清5-HT、5-HT3R、5-HT4R蛋白表达比较

2.2枳术汤对大鼠结肠肌电的影响 与对照组比较,模型组、莫沙必利组和枳术汤组结肠肌电频率明显降低,振幅明显增高(均P<0.05);与模型组比较,莫沙必利组和枳术汤组结肠肌电频率明显升高,振幅明显降低(均P<0.05)。见表1。

2.3枳术汤对大鼠血清5-HT表达的影响 与对照组比较,模型组、莫沙必利组和枳术汤组大鼠血清5-HT含量明显升高(均P<0.05);与模型组比较,莫沙必利组和枳术汤组血清5-HT含量明显降低(均P<0.05)。见表1。

2.4枳术汤对大鼠结肠组织5-HT3R、5-HT4R蛋白表达的影响 与对照组比较,模型组、莫沙必利组和枳术汤组结肠组织5-HT3R、5-HT4R蛋白表达量明显降低(均P<0.05);与模型组比较,莫沙必利组和枳术汤组结肠组织5-HT3R、5-HT4R蛋白表达量明显升高(均P<0.05)。见表1。

2.5枳术汤对大鼠肠道菌群门分布的影响 所有样本菌群由变形菌门、拟杆菌门、螺旋菌门和厚壁菌门、其他菌门构成。与模型组比较,对照组、莫沙必利组和枳术汤组变形菌门相对丰度明显升高(均P<0.05);与模型组比较,莫沙必利组和枳术汤组变形菌门相对丰度明显降低(均P<0.05)。见表2。

表2 各组肠道菌群菌门相对丰度

3 讨 论

枳术汤是《金匮要略》名方,广泛用于临床中,随着中医学不断发展,针对多种疾病,枳术汤衍化出多种变方,治疗多种疾病具有显著效果。研究显示枳术汤及其变方治疗的优势病种为消化系统疾病,包括功能性消化不良〔9〕、功能性便秘〔10〕、肠易激综合征〔11〕等,通过双向调节作用影响食道、胃、大小肠动力,从而改善消化系统疾病。本研究的枳术汤由白术颗粒剂与炒枳实颗粒剂混合制成,是健脾理气方中的经典药对,具有消食化积、消痞除满之功〔12〕。本研究结果提示,肠道传输功能出现异常,建模的大鼠出现功能性便秘。而应用枳术汤治疗的功能性便秘大鼠,胃肠排空时间缩短,粪便湿重增加,表明枳术汤治疗功能性便秘大鼠具有重要疗效。王郁金等〔13〕认为,结肠肌电频率和振幅改变,与结肠平滑肌收缩相关,亦可作为评估肠道传输功能的指标。本研究结果进一步证实,枳术汤有利于肠道传输。

研究发现,肠道菌群紊乱是功能性便秘始作俑者,当肠道菌群平衡状态被打破时,会影响身体的新陈代谢,在病理生理作用下,加剧便秘〔14〕。正常肠道含有多种致病菌和生理性细菌,在正常生理状态下,这些细菌处于相对稳定的平衡状态,它们以各种方式参与身体的生理功能,如通过分泌含酶的代谢物补充消化酶,促进体内物质的消化、吸收和代谢,或加速高产内膜上皮细胞的发育和血管组织的再生,稳定人体免疫系统,防止病原菌繁殖和分化〔15～17〕。肠道菌群动态平衡失调,加剧病原菌增殖,大量致病菌的释放会增加人体肠道内的内毒素,破坏肠黏膜屏障,导致肠道功能障碍〔18,19〕。5-HT是一种重要的胆碱能递质,能改善肠道通透性,增加肠道渗透压,增加水分分泌,促进肠道蠕动,对调节胃肠运动和胃肠分泌功能起重要作用〔20〕。当肠道受到刺激时,肠嗜铬细胞会释放大量5-HT,其与肠道上的5-HT受体结合,发挥生理作用〔21〕。5-HT3R、5-HT4R最为5-HT重要结合受体,对调节胃肠运动功能具有关键性作用,5-HT3R激活时可调节细胞外Ca2+的浓度,有助于提高胃肠道运动能力〔22〕。5-HT4R激活后促进平滑肌收缩,亦有助于肠道运动。本研究结果说明,枳术汤能够改善功能便秘大鼠肠道菌群失衡。此外,本研究结果表明,5-HT结合受体后,结肠受体表达减少,侧面证实5-HT对肠道运动作用的影响。