胃泌素调控Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响

崔光锐 杨维忠 邱坚 林文会

(海南医学院第二附属医院消化内镜科,海南 海口 570311)

胃癌是一种临床上较为常见的恶性肿瘤,具有较高的致死率,位居所有恶性肿瘤死亡率第二位,严重威胁者患者的生命健康,也给个人及家庭带来严重的经济负担〔1〕。研究表明,胃癌的发生和发展与异常表达的胃肠道激素有着密切的关系,而胃泌素就是一种胃肠道激素〔2〕。胃泌素由胃窦部G细胞产生的胃肠肽激素,主要作用是促进胃酸分泌及保护胃黏膜,同时发现胃泌素在胃癌发生及发展的过程中有着重要的作用〔3〕。研究发现〔4〕,胃泌素是一种促生长因子,胃肠的肿瘤细胞可以产生胃泌素,具有促进肿瘤细胞增殖和分化的作用,出现淋巴转移的胃癌患者胃泌素的表达量明显高于原发胃癌组织,推测胃泌素与胃癌细胞的侵袭及转移密切相关。Wnt/β-catenin通路与多种人类癌症发展密切相关,能参与癌细胞生长分化、迁移和侵袭等过程影响癌症进展〔5〕。本文探讨胃泌素调控Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人胃癌细胞MKN45购自成都埃法生物科技有限公司;DMEM培养基购自Sigma公司;人胃泌素、丙谷胺、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)购自上海碧云天生物技术有限公司;噻唑蓝(MTT)、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)总蛋白检测试剂盒、Transwell小室购自武汉博士德生物工程有限公司;一抗、二抗购自美国Hyclone公司;c-myc抗体、Wnt3a抗体、β-catenin抗体购自北京博奥森公司;电泳仪、酶标仪购自Thermo公司。

1.2细胞培养及分组 将人胃癌细胞MKN45放置含有10%胎牛血清的DMEM培养基内,置于37 ℃、5%CO2培养箱内孵育,传代培养时,加入胰酶消化培养,每2 d换1次培养液培养。取对数生长期细胞,以1×105/孔接种于6孔板中,将细胞分为对照组(不进行任何药物处理)、胃泌素组(12.50 mg)、丙谷胺组(16.00 mg/L)及胃泌素联合丙谷胺组(12.50 mg/L胃泌素与16.00 mg/L丙谷胺),每组8株人胃癌细胞MKN45。

1.3检测人胃癌细胞MKN45增殖能力 每组细胞接种在96孔培养板内,用不同条件处理24 h后在每个培养孔内加入20 μl MTT试剂盒检测液,在培养箱中继续培养4 h,取出培养板并震荡,而后在酶标仪上读取450 nm波长处的吸光值。

1.4检测人胃癌细胞MKN45迁移能力 各组MKN45细胞以胰酶消化,铺板6孔板,待细胞贴壁后呈单层汇合时,使用无菌枪头做划痕,观察并记录划痕距离,继续培养24 h后,再次观察并记录划痕宽度。

1.5检测人胃癌细胞MKN45侵袭能力 各组MKN45细胞以无血清培养液洗涤并调整密度为1×105个/ml,上室添加100 μl细胞悬液,下室添加含10%胎牛血清培养液500 μl,培养24 h。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗小室,拭去上室膜的细胞,多聚甲醛固,结晶紫染色,计数穿膜至小室的细胞数。

1.6检测人胃癌细胞MKN45凋亡率 密度为1×106个/ml细胞接种到细胞培养皿中,培养48 h后,离心收集细胞,添加膜联蛋白(Annexin)-Ⅴ、碘化丙啶(PI)染液,室温下避光孵育15 min。通过30 μm筛网过滤单个细胞,Annexin-Ⅴ和PI双重染色坏死细胞,Annexin-Ⅴ染色凋亡细胞,置于流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.7Western印迹法检测相关通路蛋白表达水平 培养24 h后细胞进行裂解并制备成电泳上样液,BCA法检测上样液浓度后计算具体上样量,电泳后转膜,经封闭、洗膜后,孵育c-myc、Wnt3a、β-catenin一抗(均1∶1 000稀释)过夜,次日经洗膜后常温下孵育二抗,时间为90 min,洗膜3次后用吸水纸吸干膜上多余液体,放入暗室内进行化学发光反应,应用ImageJ软件进行分析。以β-actin为内参蛋白。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组人胃癌细胞MKN45增殖能力比较 与对照组相比,胃泌素组细胞增殖能力明显升高,丙谷胺组细胞的增殖能力明显降低,胃泌素联合丙谷胺组细胞增殖能力明显升高(P<0.05);与胃泌素组相比,丙谷胺组、胃泌素联合丙谷胺组细胞增殖能力明显降低(P<0.05);与丙谷胺组相比,胃泌素联合丙谷胺组细胞增殖能力明显升高(P<0.05),见图1、表1。

表1 各组人胃癌细胞MKN45增殖、迁移、侵袭、凋亡能力及相关通路蛋白表达比较

图1 各组人胃癌细胞MKN45增殖能力(MTT,×200)

2.2各组人胃癌细胞MKN45迁移能力比较 与对照组相比,胃泌素组人胃癌细胞MKN45迁移能力明显升高,丙谷胺组MKN45迁移能力明显降低,胃泌素联合丙谷胺组MKN45迁移能力明显升高(P<0.05);与胃泌素组相比,丙谷胺组、胃泌素联合丙谷胺组MKN45迁移能力明显降低(P<0.05);与丙谷胺组相比,胃泌素联合丙谷胺组MKN45迁移能力明显升高(P<0.05),见表1、图2。

图2 各组人胃癌细胞MKN45迁移能力(×200)

2.3各组人胃癌细胞MKN45侵袭能力比较 与对照组相比,胃泌素组人胃癌细胞MKN45侵袭能力明显升高,丙谷胺组MKN45侵袭能力明显降低,胃泌素联合丙谷胺组MKN45侵袭能力明显升高(P<0.05);与胃泌素组相比,丙谷胺组、胃泌素联合丙谷胺组MKN45侵袭能力明显降低(P<0.05);与丙谷胺组相比,胃泌素联合丙谷胺组MKN45侵袭能力明显升高(P<0.05),见表1、图3。

图3 各组人胃癌细胞MKN45侵袭能力(结晶紫染色,×200)

2.4各组人胃癌细胞MKN45凋亡能力比较 与对照组相比,胃泌素组人胃癌细胞MKN45凋亡能力明显降低,丙谷胺组MKN45凋亡能力明显升高,胃泌素联合丙谷胺组MKN45凋亡能力明显降低(P<0.05);与胃泌素组相比,丙谷胺组、胃泌素联合丙谷胺组MKN45凋亡能力明显升高(P<0.05);与丙谷胺组相比,胃泌素联合丙谷胺组MKN45凋亡能力明显降低(P<0.05),见表1、图4。

图4 各组人胃癌细胞MKN45凋亡

2.5各组相关通路蛋白表达水平比较 与对照组相比,胃泌素组c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平明显升高,丙谷胺组c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平明显降低,胃泌素联合丙谷胺组c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与胃泌素组相比,丙谷胺组、胃泌素联合丙谷胺组c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与丙谷胺组相比,胃泌素联合丙谷胺组c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平明显升高(P<0.05),见表1、图5。

3 讨 论

随着人们不良的作息和饮食习惯,目前胃癌的发生率都在逐年升高,同时死亡率也在逐年升高〔6〕。在中国胃癌属于高发国家,每年患有胃癌的人数占全球的40%左右〔7〕。通常发生胃癌原发肿瘤的死亡人数比较小,仅占10%,大多数患者主要死于胃癌的侵袭及远处转移,尤其是肝转移〔8〕。而胃癌细胞增殖、侵袭及转移是胃癌主要的病理学特征,由于这个病理学特征,使得胃癌在医学上的治疗比较困难,同时也会使患者的预后不佳〔9〕。

研究发现,胃癌的发生及发展与胃泌素有着密切的关系,同时已有研究证实,胃泌素可以促进细胞的增殖、侵袭及转移,可以将胃泌素作为临床诊断早期胃癌的标志〔10,11〕。有学者研究发现,胃癌组织中胃泌素的表达含量明显高于其邻近正常组织,胃泌素的上调与胃癌的发生机制有着密切的关系〔12〕。胃泌素的主要作用机制促进胃癌细胞的增殖、侵袭及转移,并抑制胃癌细胞凋亡,同时刺激胃癌细胞,导致产生肿瘤血管等〔13〕。本研究结果表明,胃泌素促进胃癌细胞增殖,丙谷胺阻滞胃泌素对胃癌细胞的增殖作用,这与刘骏〔14〕等研究结果相符合。本研究结果表明,胃泌素可以增强胃癌细胞的侵袭、转移能力,降低其凋亡能力,丙谷胺可以降低胃癌细胞的侵袭、转移能力,增强其凋亡能力。此外,说明丙谷胺可拮抗胃泌素促进的胃癌细胞增殖、侵袭及转移能力,这与王斌峰等〔15〕研究结果相符合。

Wnt/β-catenin信号传导途径是一类传导生长刺激信号的通路,由细胞外的Wnt3a蛋白及胞质内的β-catenin及下游的转录因子组成〔16〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白,c-myc是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶点〔17〕。wnt/p-catenin也被称为经典的Wnt信号通路,该通路主要通过β-catenin的核易位,激活下游IE基因的转录〔18〕。一些激素或因子激活了Wnt/β-catenin信号通路,导致某些复合物对β-catenin磷酸化产生抑制作用,β-catenin降解被减少,使β-catenin在细胞内聚积并向核内转移〔19〕。胃泌素通过某些上调基因表促进胃癌细胞增殖、侵袭及迁移的能力,抑制其凋亡能力,表明Wnt/β-Catenin信号转导通路可能是胃癌发生与转移的关键通路〔20〕。本研究结果表明,胃泌素上调Wnt3α、β-catenin 及其下游基因c-myc的表达,因此胃泌素对Wnt/β-catenin信号通路有一定的活化作用,而丙谷胺可以抑制胃泌素这一作用。

综上,胃泌素通过Wnt/β-catenin信号通路上调c-myc、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平,并促进胃癌细胞增殖、侵袭及转移能力,抑制其凋亡能力。