玉屏风颗粒通过调控TLR9/AP-1信号通路对过敏性鼻炎大鼠鼻黏膜重塑、白三烯水平及免疫调节的作用

刘顺利 粱萌萌 刘大英 刘夏辉 何伟

(1河北省沧州中西医结合医院,河北 沧州 061000;2沧州师范学院生命科学系)

过敏性鼻炎(AR)作为医院耳鼻喉科较常见病症之一,由于环境影响发病率呈逐年上升趋势〔1〕。AR的发生机制复杂多样且关联因素较多,与多种呼吸系统疾病的发生发展密切相关,若不及时进行有效的诊疗,可对鼻黏膜组织造成一定的影响,并可能演变为支气管哮喘、鼻息肉及鼻窦炎等多种疾病〔2〕。AR的产生还往往伴有明显的白三烯水平异常、气道收缩及黏液分泌失衡等。半胱氨酰白三烯(CysLTs)作为一种具有关键性的炎症介质,可经CysLT1、CysLT2等受体亚型而发挥作用,可参与支气管哮喘、AR等多种炎症疾病发生发展〔3〕。Toll样受体(TLRs)家族在机体免疫反应中具有关键性作用,在与相对应的配体联合后通过集合通路干预人体中相关免疫炎性反应。激活蛋白(AP)-1是由原癌基因蛋白(C-Jun)及细胞癌基因fox蛋白(C-Fos)核蛋白基因相互构成,存在于TLR9信号通路的下游部分,在参与AR相关炎症反应及促进炎症发生等方面具有重要作用〔4〕。近年来,对于中医药在临床疾治疗中的应用越来越广泛,而中药方剂玉屏风颗粒是从元朱丹溪的《丹溪心法》之中而来,由黄芪、白术、防风等多种中药材组成,具有增强免疫、抑汗抗菌、补气中位、预防过敏等多中药理学功效,且在临床中也多有应用〔5〕。本研究探讨玉屏风颗粒通过调控TLR9/AP-1信号通路对AR大鼠鼻黏膜重塑、白三烯水平及免疫调节的作用。

1 材料与方法

1.1实验大鼠 选取健康大鼠60只,体质量120～230 g,由广东省医学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号SCXK(粤)2020-0035,饲养室温环境15～22 ℃,每日光照12 h,湿度35%～60%,喂养条件以自来水及标准饲料自由摄取在动物实验室常规饲养,大鼠实验中的所有操作步骤严格依据实验动物伦理委员会与使用指南严格进行。

1.2药物、试剂与仪器 玉屏风颗粒(广东环球制药有限公司,批号161315),氯雷他定(上海拜耳医药有限公司,批号SH00426),白细胞介素(IL)-4、组胺(HIS)、免疫球蛋白(Ig)E、肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒 (天津安诺康生物技术有限公司,批号384170692、337170718、348170718、366170714),戊巴比妥钠(成都市科龙化工试剂厂,批号2016083062),C-Fos、C-Jun抗体(美国Santa Cruz公司),辣根过氧化物酶(HRP)标记亲和纯化山羊抗鼠IgG二抗(上海沪峰化工有限公司),卵清蛋白(美国Sigma-Aldrich公司),氢氧化铝(美国International Laboratory公司,批号365724),聚合酶链反应(PCR)检测试剂盒(上海美旋生物公司),电子分析天平(德国Sartorius公司),离心机、恒温水浴锅(美国BioRad公司),多功能酶标仪(美国Ther-mo公司)。

1.3模型建立 除10只为健康大鼠外,其余50只均依据文献〔6〕使用卵清蛋白致敏法建立过敏性鼻炎模型。造模过程中将0.3 mg卵清蛋白、300 mg氢氧化铝粉末及1 ml生理盐水共同混合配制成悬液后,注入大鼠腹腔内,1次/d、2 g/L进行为期20 d的基础致敏,另加上卵清蛋白生理盐水向鼻腔中滴加1次/d,10 μm/次,共计1 w。在最后1次对大进行致敏后的1 h内使用量化叠加计分法进行计分,当大鼠少量接触鼻部且喷嚏数低于3次为1分,当大鼠数次触碰鼻部且喷嚏次数在9次内为2分,当大鼠接触鼻部十分频繁且喷嚏次数超过9次为3分,且分值超过5则为AR大鼠建模成功,本次参与建模实验的大鼠均建模成功。

1.4分组给药 将大鼠分为健康(A)组、模型(B)组、玉屏风颗粒低剂量(C低)组、玉屏风颗粒中剂量(C中)组、玉屏风颗粒高剂量(C高)组、氯雷他定(D)组,各10只。C高、中、低组采用5.40、2.70、1.35 g/kg灌胃,氯雷他定组以0.90 mg/kg灌胃,A组和B组给予等量生理盐水灌胃,均连续干预30 d。

1.5ELISA检测血清TNF-α、IL-4、IgE、HIS水平 采集大鼠尾静脉血液样本0.5 ml,置于1.0 ml经4%乙二胺四乙酸(EDTA)钠盐溶液处理的试管中,以3 000 r/min离心5 min,分离血浆,用ELISA法检测血浆中IL-4、HIS、IgE、TNF-α水平,操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.6苏木素-伊红(HE)染色 将大鼠经10%戊巴比妥钠3 ml/kg腹腔麻醉后采用脱臼法将其处死,剔除上颌骨部分的组织,并将其分离,把鼻背从中间进行切开,将鼻中隔机器两侧的鼻腔露在外部,鼻中隔及其鼻黏膜组织进行有序剥离,采集双侧鼻黏膜组织,放在10%的甲醛溶液中进行固定,常规石蜡包埋、切片、HE染色后于光学显微镜下观察病理组织。

1.7鼻黏膜中嗜酸性粒细胞(EOS)检测 行HE染色后,在显微镜下选择5个视野(面积675.2 mm×498 mm)以细胞有分叶核及细胞质中有嗜酸性颗粒为标准,进行EOS计数,5个/张病理切片,1个EOS为1个计数。

1.8Western印迹检测C-Fos、C-Jun蛋白 取大鼠鼻黏膜组织1 g进行匀浆裂解,TIP管吸打,冷存静置30 min,转移至离心管5 ℃,10 000 r/min离心30 min,取上清液冻存,测定蛋白含量,取总蛋白,高温变性,电泳,C-Fos转膜40 min,C-Jun转膜15 min,5%脱脂奶粉封闭1 h,加一抗C-Fos(1∶1 000)、C-Jun(1∶500),β-actin(1∶2 000)5 ℃孵育过夜,TBST液洗膜,HRP标记的二抗(1∶5 000)室温孵育1 h,洗涤,曝光显影,用ImageJ软件分析图像,以β-actin为内参,相应蛋白条带灰度值/β-actin表示C-Fos、C-Jun相对表达量。

1.9反转录(RT)-PCR检测白三烯受体(CysLT1-R)和CysLT2-R基因mRNA的表达 取大鼠鼻黏膜组织,用Trizol试剂提取总RNA,制成匀浆后加100 μl氯仿,摇匀后低速离心15 min,洗涤后提取总RNA,按照反转录试剂盒说明书,取1 μg总RNA逆转录后取得互补DNA,以β-actin为内参,用RT-PCR分别扩增CysLT1-R、CysLT2-R基因,设置反应体系,反应条件为80 ℃ 5 min,90 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,75 ℃ 延伸30 s,共40个循环。基因相对表达量=2-ΔΔCt,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-actin)。CysLT1正向：5′-TCTCCGTTTGTGGGTTTCT-3′,反向：5′-TATAAGGC ATAGGTGGTG-3′;CysLT2正向：5′-AG CGTTAGGCATAAAGGGT-3′,反向：5′-CAAGTGTAGTAGGCTAG TA-3′;β-actin正向：5′-CCTACCATTGACGGTGATGC-3′,反向：5′-TACGGTCTTAATCTTCGAATC-3′。

1.10统计学方法 采用GraphPad Prism8.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组鼻黏膜病理组织HE染色 A组鼻黏膜结构及组织生长良好,无EOS血管浸润、血肿等不良反应;B组与C低组鼻黏膜内部组织伴有明显大量EOS浸润产生及黏膜上皮损伤脱落,黏膜下腺体增生和血管扩张充血现象;C中组与D组鼻黏膜仍有部分肿胀及嗜酸性粒细胞,仍有炎性浸润现象;C高组鼻腔黏膜中仍有少量水肿和轻度血管扩张现象,且EOS浸润明显降低,见图1。

图1 各组鼻黏膜病理组织(HE染色,×200)

2.2各组血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS水平 与A组相比,B组血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS水平明显增高(P<0.05);与B组比较,C中组上述指标明显降低(P<0.05);与C中组相比,C高组上述指标明显降低(P<0.05)。与C高组比较,D组上述指标明显增高(P<0.05);B组与C低组无明显差异(P>0.05),C中组与D组比较无明显差异(P>0.05),见表1。

表1 各组血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS水平及鼻黏膜组织中EOS细胞表达比较

2.3各组鼻黏膜组织中EOS细胞 与A组比较,B组鼻黏膜组织中EOS细胞明显增多(P<0.05);与B组比较,C中组鼻黏膜组织中EOS细胞明显减少(P<0.05);与C中组比较,C高组鼻黏膜组织中EOS细胞明显减少(P<0.05);与C高组比较,D组鼻黏膜组织中EOS细胞明显增多(P<0.05);B组与C低组无明显差异(P>0.05),C中组与D组无明显差异(P>0.05),见表1。

2.4各组鼻黏膜组织中CysLT1和CysLT2受体mRNA表达 与A组比较,B组鼻黏膜组织中CysLT1和CysLT2 mRNA表达明显升高(P<0.05);与B组比较,C中组上述指标明显降低(P<0.05);与C中组比较,C高组上述指标明显降低(P<0.05);与C高组比较,D组上述指标明显增高(P<0.05);B组与C低组无明显差异(P>0.05),C中组与D组无明显差异(P>0.05),见表2。

表2 各组鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun蛋白及CysLT1和CysLT2 mRNA表达比较

2.5各组鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun蛋白表达 与A组比较,B组鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun蛋白表达明显升高(P<0.05);与B组比较,C中组上述指标明显降低(P<0.05);与C中组比较,C高组上述指标表达明显降低(P<0.05);与C高组比较,D组上述指标明显升高(P<0.05);B组与C低组无明显差异(P>0.05),C中组与D组无明显差异(P>0.05),见表2、图2。

图2 各组鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun蛋白表达

3 讨 论

AR的产生常表现为呼吸区的鼻黏膜组织结构发生改变,包括细胞外基质的不断聚积、杯状细胞生化、黏膜纤毛上皮细胞和血管新生被破坏及黏膜下腺体增生等〔7〕。中医认为,AR是由脏腑虚亏、风寒入体、正邪互克、肺气阻塞、津水停聚、犯及鼻窍阻塞所致〔8〕。中药玉屏风颗粒具有固表养气,祛邪祛风等功效,临床治疗中常用于流感、免疫调节及反复性过敏病症等〔9〕。

研究发现,炎症递质引发的免疫细胞合成、释放及分解均参与了AR的发生发展〔10〕。本研究提示,玉屏风颗粒对AR大鼠血清中IL-4、TNF-α、IgE、HIS等具有一定抑制作用。目前认为,AR的产生是由致敏原接触机体导致的,且由IgE所引发的HIS及纤维蛋白溶酶等相关介质大量释放而引起的Ⅰ型变态反应,在过程中通过与多种免疫因子相结合而引发喷嚏、流涕等鼻炎反应〔11〕。相关研究发现,西药氯雷他定作为长效三环类抗HIS药物,具有起效快、疗效较持久等特点,但停药后疾病的复发率较高〔12〕。玉屏风颗粒可通过发挥中药黄芪、白术等成分对免疫的双向调节作用,在AR的治疗中通过抑制炎症释放,改善由于炎性递质传递所导致的毛细血管扩张、血管通透性增加等引起的多种过敏反应,从而改善机体的致敏状态,在免疫调节中发挥疾病调节作用〔13〕。

EOS是AR中的炎症细胞,也是重要的炎症指标,在变态反应中EOS会产生脱颗粒现象,并通过释放大量趋化因子和炎性细胞进而加重疾病反应。本研究提示,玉屏风颗粒对抑制AR大鼠鼻黏膜组织中EOS细胞活化具有积极作用。以往研究发现,在AR的发生过程中,EOS趋化因子使得血液中的炎性因子大量聚合,致使鼻腔中产生较多的分泌物及EOS细胞,并在炎性因子活化、细胞黏附、移行及趋化的同时扩张鼻黏膜血管,使机体处于致敏状态并增加局部组织水肿〔14〕。中医将AR归为“鼻衄”范畴,其病理反应为肺部虚薄、气虚不受、鼻损入窍,进而使得肺腑失固、窍内酸塞。因此,对于AR的治疗应以补正固卫、益气祛邪为主〔15〕。玉屏风颗粒中的防风、白芍、辛夷等可通过发挥抑制组胺和抗过敏介质、收缩鼻腔内血管黏膜及抑制肥大细胞脱颗粒等作用,继而发挥AR的治疗作用。续艳等〔16〕在研究中发现,防风、白芍可显著降低AR大鼠鼻分泌物EOS数量。可见在AR治疗中,玉屏风颗粒相关中药成分抑制B细胞合成过敏原特异性免疫球蛋白,缓解副交感神经兴奋导致的腺体分泌、黏膜充血的同时,阻断免疫活性细胞和细胞因子所致的EOS恶性增长和鼻黏膜炎性反应。

以往研究发现,CysLTl、CysLT2受体对增加血管通透性,增强心肌缺血再灌注损伤等具有关键作用,并可参与包括鼻咽炎等呼吸系统炎症疾病的发生发展过程之中。本研究提示,玉屏风颗粒对抑制AR大鼠鼻黏膜组织中CysLT1和CysLT2 mRNA增长具有积极作用。相关研究表示,当机体与变应原接触时可诱导鼻腔区域的EOS及肥大细胞脱颗粒活化,并通过释放白三烯等炎性介质对鼻黏膜的感觉神经末梢及兴奋副交感神经等产生刺激,引起鼻痒、流涕及喷嚏频繁等过敏反应〔17〕。李泳文等〔18〕研究发现,玉屏风颗粒在抑制过敏原特异性IgE合成的同时也阻断了白三烯、前列腺素及Th2 细胞因子等多种炎性介质的进入从而降低鼻塞、流涕等过敏反应。氯雷他定虽也能在一定程度上降低HIS H1受体和肥大细胞等释放白三烯,但其作用效果仍低于玉屏风颗粒。

C-Fos、C-Jun为早期的即刻反应基因,能够参与有关基因的调控和疾病的表达,且C-Fos蛋白并不能直接与DNA相结合,而是与C-Jun联合构成异二聚体发挥效用。本研究提示,玉屏风颗粒可能对降低AR大鼠鼻黏膜组织中C-Fos、C-Jun蛋白表达具有一定影响。Gui等〔19〕研究表示,药物抗AR作用机制可能与AP-1、TNF-α等因素有关。在AR中TLR可能在受到病原体的刺激后,通过激活多个信号传导通路及免疫活性细胞诱导相关基因的表达,参与体内炎症及免疫反应的发生发展〔20〕。黄芪可双向调节机体的免疫、改善毛细血管通透性等功效发挥抗病毒和抑菌效用〔21〕。李承德〔22〕在相关研究中表示,黄芪能够使大鼠海马磷酸化的c-Fos和c-Jun水平显著下降,并有改善炎症因子的作用。推测玉屏风颗粒治疗AR可能是通过调节炎症途径的关键转录因子、生长因子等的分泌,增加血清中Ig含量,进而在机体免疫调节中发挥抑制AP-1及其下游因子的释放和分泌IgE、IL-4、TNF-α等,起到解表祛风、共利鼻窍等抑制疾病的作用。

综上,玉屏风颗粒对改善AR大鼠鼻黏膜组织重塑,调节其免疫应答反应,降低促炎因子及白三烯水平的作用机制可能是通过TLR9/AP-1等来实现的。但对于C-Fos、C-Jun在组织重塑的具体效果仍有待进一步研究。且在考虑药物成本及有效性、安全性的同时,为达到临床症状控制和改善病情反复的目的可以考虑使用玉屏风颗粒。