热量限制对db/db小鼠胰岛β细胞退分化的影响

李景 刘梦冉 田胜达 李文毅 夏世金 张宏利 李晓华

(1上海中医药大学附属第七人民医院内分泌科,上海 200137;2上海交通大学附属同仁医院虹桥国际医学研究院;3复旦大学附属华东医院上海市老年医学研究所)

流行病学调查显示,我国成人糖尿病发病率为11.2%,老年人群糖尿病患病率超过20%〔1〕。胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病发病的核心机制,导致胰岛β细胞功能损伤的原因有多种,包括β细胞胰岛素合成和分泌能力下降,增殖减少,凋亡增加,退分化增多等。其中β细胞退分化是近年发现的导致β细胞功能损伤的新机制〔2〕。生活方式干预是预防和治疗2型糖尿病的基础,热量限制(CR)是目前较为有效的生活方式干预手段,现发现CR具有抗衰老的作用,而2型糖尿病也是常见的衰老相关性疾病。CR可通过减轻肥胖和胰岛素抵抗改善糖尿病,也可通过改善胰岛β细胞分泌功能,抑制β细胞凋亡,抗氧化应激,恢复β细胞特异性转录因子表达等机制改善胰岛β细胞功能〔3〕。但其对β细胞退分化的影响目前仍不明确。本研究以db/db糖尿病小鼠为对象,探讨CR对db/db小鼠糖代谢、胰岛β 细胞功能及去分化的影响,为通过CR预防和治疗2型糖尿病提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1实验动物 SPF级3周龄雄性C57BL/6J小鼠,体质量8～10 g共10只;SPF级3周龄雄性db/db小鼠,体质量10～12 g共20只,购于南京集萃药康生物科技公司,许可证号：scxk(苏)2020-0004。室温20～25 ℃,自由饮水,12 h/12 h昼夜明暗交替日光灯照明。动物使用及实验设计均符合上海中医药大学实验动物管理委员会的相关规定。

1.2实验分组 C57BL/6J小鼠予自由进食,设定为C-FD组(n=10)。db/db小鼠随机分为两组,每组10只。其中一组db/db小鼠自由进食,设定为db-FD组,另一组CR予C-FD组60%饲料喂养,设定为db-CR组。每周检测体质量、测空腹血糖1次至小鼠9周龄时共6 w实验结束。

1.3主要试剂 小鼠普通饲料购于北京科澳协力饲料有限公司;血糖试纸和血糖仪购于罗氏公司;小鼠超敏胰岛素酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于Crystal Chem公司;胰岛素单克隆抗体购自invitrogin公司;胰腺十二指肠同源蛋白(Pdx)1、NK6同源框1(Nkx6.1)和叉头盒(FOX)O1兔多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司; 乙醛脱氢酶家族1成员(ALDH1)A3兔多克隆抗体购自Millipore公司; 异硫氰酸荧光素(FITC)标记及四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的二抗购自Abcam公司;二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于福建迈新生物公司;伊红染料购于上海碧云天有限公司;Ⅺ型胶原酶购自美国Sigma公司。

1.4糖耐量和胰岛素耐量实验 小鼠禁食12 h后,行糖耐量实验,按照2 g/kg体质量的剂量腹腔注射葡萄糖,并在0、15、30、60、120 min取血检测血糖;小鼠禁食6 h后进行胰岛素耐量试验,按照0.75 IU/kg体质量的剂量腹腔注射胰岛素,并在0、15、30、45、60 min取血检测血糖,以上实验均采用尾静脉取血,使用罗氏血糖仪测定血糖水平。

1.5胰岛素含量测定 分离小鼠胰腺,加入8 ml酸化乙醇,匀浆后充分震荡,置于摇床4 ℃过夜,离心取上清,测量溶液体积,使用ELISA测定胰岛素水平。

1.6胰腺组织免疫组化和免疫荧光染色 小鼠胰腺组织分离后,固定包埋切片。切片脱蜡,水化,用柠檬酸抗原修复液修复后,一抗孵育(胰岛素抗体1∶200)过夜后,加入过氧化物酶标记二抗,DAB显色后,伊红染色,封片后显微镜下采集图片。免疫荧光双染色,胰腺组织切片抗原修复后,一抗(胰岛素抗体1∶200;Pdx1 1∶200;Nkx6.1 1∶100;FOXO1 1∶100;ALDH1A3 1∶50) 孵育过夜,FITC和TRITC标记的二抗室温孵育1 h,封片后荧光显微镜下采集图片。

1.7胰岛分离 采用原位胶原酶灌注法进行分离,小鼠胆总管插管灌注0.5 mg/ml Ⅺ型胶原酶溶液,分离胰腺,37 ℃水浴消化,过筛后,体式显微镜下手工挑选,保存在-80 ℃冰箱待测。

1.8RNA-seq分析 分离的小鼠胰岛进行 RNA 抽提,建库,利用 Illumina Hiseq 测序仪上机测序,测序数据质量评估采用软件 FastQC(版本0.10.1)进行分析,对低质量的测序数据过滤采用软件Cutadapt(版本1.9.1),参考序列的比对分析采用软件 Hisat2(版本2.0.1)。 以差异倍数(FC)≥2且错误发现率(FDR)<0.01 作为标准,利用DESeq2进行样品组间的差异表达分析,筛选差异表达基因。利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对差异表达基因进行通路富集分析。

1.9统计学处理 采用SPSS12.0进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1CR改善db/db小鼠体质量、糖代谢和胰岛素敏感性 3组实验期间随着周龄的增加体质量逐渐增高,其中db-FD组体质量增加明显,2 w后db-FD组体质量与C-FD和db-CR组相比均有明显差异,而db-CR组体质量在5 w时才较C-FD组明显升高(P<0.05)。db-FD组从3 w开始空腹血糖水平较C-FD组明显升高,而db-CR组从4 w开始较C-FD组空腹血糖水平显著升高,db-CR组空腹血糖水平从4 w开始较db-FD组明显降低(P<0.05)。糖耐量实验显示,db-CR组糖耐量曲线处于db-FD组与C-FD组之间,糖耐量较db-FD组明显改善(P<0.05),胰岛素耐量实验显示,db-CR组胰岛敏感性(30 min后)较db-FD组明显改善(P<0.05)。以上结果证实CR可改善db/db小鼠糖代谢。见表1～4。

表1 各组实验期间每周体质量

表2 各组实验期间每周空腹血糖

表3 6 w后各组葡萄糖耐量实验各时间点血糖结果和曲线下面积

表4 6 w后各组胰岛素耐量实验各时间点血糖自基线的变化及胰岛素耐量实验曲线下面积

2.2CR改善db/db小鼠胰岛功能和形态 与C-FD组比较,db-CR和db-FD组空腹胰岛素水平均明显升高(P<0.05),这与空腹血糖水平结果一致。db-CR组空腹胰岛素水平较db-FD组明显升高(P<0.05),提示db-FD小鼠胰岛功能受损。与C-FD组相比,db-FD和db-CR组胰岛素含量均降低,但db-CR组胰岛素含量较db-FD组明显升高(P<0.05)。胰岛免疫组化显示,db-FD组胰岛内部结构松散,有较多的胰岛素染色淡染区,提示含有胰岛素的β细胞减少,而db-CR组胰岛结构明显紧密,无明显胰岛素淡染区。以上结果提示CR可以改善胰岛β细胞功能,增加db/db小鼠中胰岛素阳性细胞的数目。见表5、图1。

图1 6 w后各组胰岛切片(DAB,×400)

表5 6 w后各组空腹胰岛素水平及胰腺胰岛素含量

2.3db/db小鼠CR后胰岛β细胞功能相关基因的RNA-seq分析 从主成分分析(PCA)图中可发现,3组胰岛RNA表达具有明显差异。见图2。分别与db-FD组相比,C-FD组有1 320个基因表达改变,db-CR组有586个基因表达改变。其中262个基因为共同变化的基因。对此262个基因进行KEGG通路分析,结果显示主要与胰腺分泌,蛋白消化吸收及核因子κB信号通路等有关。对胰岛素分泌相关基因〔胰岛素1,溶质载体家族2成员(Slc2a)2,溶质载体家族30成员(Slc30a)8,钾内向整流通道亚家族成员(Kcnj)11,葡萄糖激酶(Gck),胰高血糖素样肽-1受体(Glp1r),突触体相关蛋白(Snap)25〕,胰岛β细胞特异转录因子〔Pdx1,神经源分化因子(Neurod)1,肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(Mafa),Nkx6.1,NK2同源框2(Nkx2.2)〕,胰岛β细胞分化和退分化相关基因〔神经原蛋白(Neurog)3、FOXO1、Aldh1a3、嗜铬粒蛋白(Chg)A、Y染色体性别解决定区盒转录因子(Sox)9、尿皮质素(UCN)3〕在3组胰岛中的表达进行分析,结果CR限制可逆转db/db小鼠胰岛中胰岛素分泌相关基因(胰岛素1、Slc2a2、Slc30a8、Kcnj11、Gck)表达的减少,提示CR改善了胰岛β细胞功能。Pdx-1和Nkx6.1是胰岛β细胞特异转录因子,被认定为胰岛β细胞身份的标志,其表达水平降低,可能与胰岛β细胞退分化有关。在RNN-seq分析中发现,db-FD小鼠胰岛中Pdx1和Nkx6.1表达降低,而CR上调其在db-CR组胰岛中的表达。在胰岛β细胞退分化相关基因方面,退分化的标志基因Aldh1a3和Sox9基因在db-FD小鼠胰岛中较C-FD组表达升高,说明胰岛β细胞存在退分化现象,CR后Aldh1a3和Sox9基因表达降低,提示胰岛β细胞退分化改善。FOXO1是维持β细胞分化的关键转录因子,其在CR后表达升高,也提示胰岛β细胞退分化改善。见图3、图4。

图2 3组胰岛RNA表达的PCA

图3 C-FD组和db-CR组分别与db-FD组相比共表达差异基因KEGG通路

图4 3组胰岛素分泌基因、胰岛β细胞特异转录因子和退分化相关基因的表达热图

2.4CR对db/db小鼠胰岛β细胞特异性转录因子及退分化相关因子表达的影响 db-FD组胰岛β细胞中Pdx1和Nkx6.1阳性细胞比例较C-FD组明显降低,db-CR组胰岛中Pdx1和Nkx6.1阳性细胞比例较db-FD组明显升高(均P<0.05)。维持β细胞分化的FOXO1在db-FD组β细胞核中表达较C-FD组明显降低,db-CR组FOXO1较db-FDX组表达明显升高(P<0.05)。β细胞去分化标志分子Aldh1a3在db-FD小鼠胰岛中表达升高,而在db-CR小鼠中表达降低。见图5、表6。以上结果也证实在db/db小鼠胰岛β细胞中发生退分化现象,而通过CR可改善胰岛β细胞退分化,改善胰岛β细胞功能。

图5 6 w后β细胞特异性转录因子和退分化相关蛋白的表达比较(免疫荧光染色,×400)

表6 6 w后各组胰岛中Pdx1、Nkx6.1、FOXO1和胰岛素双阳性细胞比例

3 讨 论

生活方式干预包括CR,是预防和治疗2型糖尿病的重要手段之一〔3〕。相对于药物,CR具有副作用小,安全性高的特点,对于老年2型糖尿病特别是伴发病较多,服用多种药物治疗的患者,通过CR减少糖尿病药物的摄入,会有更多获益。同时2型糖尿病本身也是衰老性疾病,CR在抗衰老方面也具有重要作用,本研究提示,CR后小鼠胰岛β细胞退分化状态改善。

饮食控制和加强运动等生活方式干预不仅是预防糖尿病的手段也是糖尿病治疗的基础。其中CR是饮食干预的一种方式,CR一般指的是为未进行饮食干预模型的50%～75%且而不发生营养不良的饮食干预方法〔4〕。CR在延长寿命、缓解炎性衰老和调控生物节律等方面发挥着重要作用,现有研究也证实,CR是一种有效的2型糖尿病干预方式〔5,6〕。通过CR可以降低2型糖尿病患者的空腹血糖和糖化血红蛋白(HbA1c)水平,对于短病程肥胖的2型糖尿病进行短期的CR甚至可以达到糖尿病缓解〔7～9〕。本研究也证实,CR可改善糖尿病小鼠的糖代谢水平。CR改善糖尿病的机制一方面是通过减轻减少脂肪堆积,减轻体质量,减少肝糖输出和改善机体的胰岛素敏感性〔10,11〕;另一方面是通过改善胰岛β细胞功能和增加β细胞量〔12〕,但具体机制目前仍未完全阐明。研究证实,CR可以提高胰岛素第一时相分泌〔13〕,在动物研究中发现给予ZDF大鼠CR后,可以提高葡萄糖刺激的胰岛素分泌〔14〕。db/db小鼠CR后β细胞凋亡和氧化应激减少,延缓了小鼠胰岛β细胞功能的丧失和β细胞量降低〔15〕。在饮食诱导的肥胖小鼠中发现,CR可通过上调自噬通路改善β细胞的功能受损〔16〕。也有研究发现,CR可促进糖尿病小鼠胰岛β细胞特异性转录因子Pdx1,MafA等表达〔17〕。本研究发现,CR减少了db/db小鼠胰岛β细胞的退分化,完善CR改善β细胞功能的机制。

胰岛β细胞退分化是近年研究发现的导致胰岛β细胞功能减退的新机制。其主要表现在血糖升高等因素导致β细胞功能蛋白或身份蛋白表达变化,分化成熟的正常β细胞失去成熟细胞的特征,进而丧失部分或全部胰岛素分泌能力〔18〕。有研究发现,在2型糖尿病患者和动物模型中均能观察到β细胞退分化的现象〔2,19,20〕。如Cinti等〔19〕通过研究β细胞特异转录因子的表达变化,证实人类糖尿病患者胰岛β细胞存在去分化现象。Talchai等〔2〕在2 型糖尿病小鼠模型的胰岛中,观测到胰岛素染色阴性和嗜铬粒蛋白A(内分泌前体细胞的标志物)染色阳性的细胞,并通过细胞谱系示踪证实β细胞发生了退分化。β细胞发生退分化时与其功能和成熟相关的转录因子如MafA,Pdx1,Nkx6.1等表达降低,前体细胞标记蛋白Aldh1a3表达升高。本研究也得到类似结论。同时也有研究发现,FOXO1是维持 β 细胞成熟和身份的关键转录因子,FOXO1 缺失的β细胞中出现内分泌前体标志基因(Ngn3)表达,β细胞的标志基因(Mafa)和胰岛素表达明显降低,β细胞出现退分化现象〔2〕,目前研究还发现,退分化的过程是可逆的,当解除高血糖状态后,退分化的β细胞可再分化为成熟β细胞〔21〕。故寻找减少β细胞退分化或促进再分化的方法也是目前糖尿病治疗研究的热点,本研究结果为相关研究提供了一定实验基础。同时,本研究仍存在一定缺陷。首先,本文是通过β细胞特异转录因子、前体细胞标记蛋白及退分化相关蛋白等的表达变化评估β细胞退分化的状态,虽然此方法简单易行,在其他研究中也广泛采用,但是基于Cre/loxp系统的细胞谱系示踪才是判断退分化的金标准,因为小鼠模型的限制本研究未进行相关实验。其次,本文仅研究了CR在db/db小鼠中的作用,对于其他糖尿病模型例如高脂饮食联合STZ诱导的2型糖尿病模型,ZDF大鼠模型未进行研究,同时CR是否对人类2型糖尿病患者的胰岛具有同样的减少去分化的作用也需探讨。在接下来的实验中,将完善相关研究,为CR饮食改善胰岛β细胞功能机制的阐明提供更有力证据。