基于TGF-β/Smad信号通路调控PTPRZ1对口腔黏膜下纤维性变的干预效果

刘佩 李泽濛 贺小宁

(海南医学院第二附属医院口腔科,海南 海口 570311)

口腔黏膜下纤维性变主要发病机制为黏膜硬化,形成条索,发病后多表现为固有层血管、纤维条索状改变等,最终妨碍口腔功能发挥,现阶段临床多采用高压氧、抗氧化剂、外源性酶类、糖皮质激素等进行治疗,虽然可改善局部微循环、减轻细胞损伤、抑制胶原沉积等,但整体疗效并不理想〔1～3〕。酪氨酸磷酸酶Z1型受体(PTPRZ1)是可调节细胞分化、细胞周期、细胞间通讯的酪氨酸磷酸酶家族成员,其表达异常可引发糖尿病、癌症等〔4〕。转化生长因子(TGF)-β/Smad在多种纤维化疾病中均发挥着重要作用,可促进纤维化形成〔5〕。本研究基于TGF-β/Smad信号通路探究调控PTPRZ1对口腔黏膜下纤维性变的干预效果。

1 资料与方法

1.1研究动物 选取65只SPF级Wistar大鼠,体质量220～260 g,由杭州拓实生物科技有限公司提供,动物许可证号：SYXK(浙)2020-0025,所有大鼠在相对湿度、室温分别为50%、23 ℃的无病原菌笼子中进行7 d适应性喂养,参照动物试验伦理要求的相关规定进行本试验操作。

1.2PTPRZ1慢病毒载体构建 LPL基因序列通过GenBanK查找序列获得,构建PTPRZ1过表达、沉默转染质粒,由上海吉玛公司设计并合成,并做慢病毒滴度测定(病毒滴度为1×109TU/ml)。

1.3分组与建模 在适应性喂养7 d后选取65只大鼠,10只为空白组,其余55只参照王宗康等〔6〕建立口腔黏膜下纤维性变模型。首先通过水合氯醛对建模大鼠进行麻醉,麻醉完成后在大鼠两侧颊黏膜下注射100 μl槟榔提取物(成都德斯特生物公司提供),1次/d,连续注射8 w,以大鼠张口受限,口腔黏膜质地变硬,颜色发白并形成条索状为建模成功,55只建模大鼠最终有45只建模成功。将建模成功的45只大鼠分为模型组、上调组(10 μl PTPRZ1过表达慢病毒悬液)、下调组(10 μl PTPRZ1默慢病毒悬液)各15只,空白组、模型组注射同剂量的蒸馏水,1次/d,连续注射7 d后,观察大鼠变化。

1.4大鼠一般情况观察 对各组大鼠活动、形态、进食、毛发光泽度等一般情况进行观察。

1.5病理学观察 于PTPRZ1转染7 d后,麻醉后将大鼠断颈处死,取大鼠颊黏膜组织,用4%多聚甲醛固定24 h,通过梯度酒精脱水、石蜡包埋后将其切为5 μm厚薄片,烘干后脱蜡,采用梯度酒精、蒸馏水行水化及洗涤,之后使用苏木素-伊红(HE)染色,于光学显微镜(上海光学仪器有限公司)下对大鼠颊黏膜组织病理形态变化进行观察。

1.6PTPRZ1、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达量检测 于PTPRZ1转染后,取大鼠颊黏膜组织,PTPRZ1、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达量通过实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)进行鉴定,提取总RNA,将颊黏膜组织中的RNA使用TaKaRa逆转录试剂盒逆转录为cDNA,采用Primer5.0软件设计引物序列,启动PCR仪。通过2-ΔΔCt方法计算出PTPRZ1、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达量。

1.7张口度检测 于PTPRZ1转染后处死前对各组张口度进行检测,首先对大鼠进行麻醉,之后将上前牙进行固定,通过计力器给予大鼠下前牙2 N力,使大鼠口腔充分打开,最后采用游标卡尺对大鼠上下前牙垂直距离进行检测,共检测3次,取平均值。

1.8颊黏膜评分 通过颊黏膜评分〔7〕对病情状况进行评估,内容包括3项(口腔颊黏膜光滑度、纤维条索、色泽),单项分值为0～3分,得分越高表明病变越严重。

1.9胶原水平检测 于PTPRZ1转染后,取颊黏膜组织,加入适量(1∶10)组织蛋白抽离液,充分碾碎,以离心半径3 cm,转速3 000 r/min,离心10 min,提取上清液,70 ℃保存待测,各组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原水平采用通过酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行检测。Ⅰ、Ⅲ型胶原 ELISA试剂盒由上海美轩生物科技有限公司提供。

1.10TGF-β/Smad信号通路蛋白相对表达量检测 通过Western印迹检测,组织中蛋白依照组织蛋白提取试剂盒说明进行萃取,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PDGE)于每孔加入80 μg蛋白后进行,电泳结束后将蛋白电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭,TGF-β1、Smad2、Smad3一抗(1∶1 000)于摇床上室温孵育,共孵育120 min,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,后将TGF-β1、Smad2、Smad3二抗(1∶1 000)于摇床上室温孵育,共孵育60 min,完成后采用TBST洗膜3次,10 min/次,化学发光显影采用电化学发光(ECL),以GAPDH为内参,相对条带灰度光密度值采用ImageJ软件分析。

1.11统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差齐性检验、重复测量方差分析。

2 结 果

2.1一般情况观察 空白组皮毛顺滑、饮食正常,活动多,反应灵敏,模型组活动少、体毛干枯缺少光泽,出现脱毛,食欲不振,畏寒蜷缩,上调组毛发枯黄杂乱,脱毛严重,食欲不振,反应迟钝,下调组食欲明显提升,活动增加,体毛光泽度恢复。

2.2病理学特征对比 如图1所示,空白组口腔颊黏膜上皮结构正常,固有层下血管、肌纤维无明显变化;模型组颊黏膜上层萎缩,出现炎性细胞浸润;上调组口腔颊黏膜炎性细胞浸润加重,固有层可见少量浆细胞;下调组口腔颊黏膜固有层上皮无明显变化,炎性细胞明显减少。

图1 各组口腔颊黏膜病理学(HE染色,×200)

2.3各组PTPRZ1表达量 如表1所示,与空白组相比,模型组、下调组、上调组PTPRZ1表达量上升,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,上调组PTPRZ1表达量上升,下调组PTPRZ1表达量下降,具有统计学差异(P<0.05);与上调组相比,下调组PTPRZ1表达量明显下降(P<0.05),说明转染成功。

表1 各组PTPRZ1表达量、张口度、颊黏膜评分、胶原水平及TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达量比较

2.4各组张口度、颊黏膜评分对比 如表1所示,与空白组相比,模型组、下调组、上调组张口度水平下降,颊黏膜评分上升,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,上调组张口度水平下降,颊黏膜评分上升,下调组张口度水平上升,颊黏膜评分下降,具有统计学差异(P<0.05);与上调组相比,下调组张口度水平上升,颊黏膜评分下降,具有统计学差异(P<0.05)。

2.5各组胶原水平对比 如表1所示,与空白组相比,模型组、下调组、上调组Ⅰ、Ⅲ型胶原水平上升,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,上调组Ⅰ、Ⅲ型胶原水平上升,下调组Ⅰ、Ⅲ型胶原水平下降,具有统计学差异(P<0.05);与上调组相比,下调组Ⅰ、Ⅲ型胶原水平下降,具有统计学差异(P<0.05)。

2.6各组TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA表达量 如表1、表2、图2所示,与空白组相比,模型组、下调组、上调组TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA表达量上升,具有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,上调组上述指标上升,下调组上述指标下降,具有统计学差异(P<0.05);与上调组相比,下调组上述指标下降,具有统计学差异(P<0.05)。

表2 各组TGF-β/Smad信号通路蛋白相对表达量比较

图2 各组TGF-β/Smad信号通路蛋白表达

3 讨 论

口腔黏膜下纤维性变病程进展缓慢、起病隐匿,颊、软腭、舌、唇、咽为口腔黏膜下纤维性变的主要发病部位〔8〕。口腔黏膜下纤维性变早期临床症状并不明显,随着疾病的进展可引发语言困难、张口受限、开口困难等影响患者正常生活的症状,因此及时有效治疗对患者生活质量提升具有重要意义〔9,10〕。

PTPRZ1是由一个碳酸酐酶结构域、一个纤维连接素结构域、两个胞质酪氨酸磷酸酶结构域、硫酸软骨素蛋白聚糖组成的单通道Ⅰ型膜蛋白,PTPRZ1异常表达与间变性大细胞淋巴瘤、小细胞肺癌、胃癌等恶性肿瘤的发生、发展、转移等存在密切联系,但关于其与口腔黏膜下纤维性变的相关研究较少〔11〕。研究发现〔12,13〕,上皮细胞-间充质转化与口腔黏膜下纤维性变癌变联系密切,而PTPRZ1可通过调控β-catenin表达抑制纤维化进程,进而阻碍了口腔黏膜下纤维性变癌变病情发展,与本文研究结果一致。表明沉默PTPRZ1可抑制口腔黏膜下纤维性变大鼠病情发展。

口腔黏膜下纤维性变病情发展过程中患者张口度水平不断下降,因此张口度水平可反映病情严重程度〔14〕。颊黏膜评分可对口腔颊黏膜光滑度、纤维条索、色泽病变程度进行评估,反映疾病进展程度〔15〕。上皮下胶原过度积累为口腔黏膜下纤维性变发生癌变的主要原因之一,Ⅰ、Ⅲ型胶原水平升高可加重胶原蛋白过度沉积情况,推动纤维化进程,进而加重患者病情〔16〕。研究发现〔17〕,PTPRZ1可激活依赖酪氨酸磷酸化,进而对TGF-β/Smad信号通路起到抑制作用,使Ⅰ、Ⅲ型胶原等通路因子水平下降,抑制了胶原沉积,改善临床症状,与本文研究结果一致。表明下调PTPRZ1可抑制口腔黏膜下纤维性变大鼠纤维化进程,缓解其临床症状。

TGF-β/Smad信号通路为典型促纤维化通路,其中TGF-β1可调控细胞增殖、分化等过程,且在多种器官、组织纤维化中TGF-β1发挥着重要作用,TGF-β1可刺激Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌,进而介导了纤维化〔18,19〕。TGF-β1结合膜受体后可使Smad2、Smad3激活,促进其形成Smad2/Smad3/Smad4复合体,之后Smad2/Smad3/Smad4复合体可转移进入细胞核中,促使Ⅰ、Ⅲ型胶原转录,推动了纤维化进程〔20,21〕。本研究发现,口腔黏膜下纤维性变大鼠经下调PTPRZ1干预后TGF-β/Smad信号通路得到抑制,病情缓解。研究发现〔22,23〕,TGF-β1与β-catenin相互影响,TGF-β1表达随β-catenin表达下降而下降,而PTPRZ1可抑制β-catenin表达,进而对TGF-β1、Smad2、Smad3表达起到抑制作用,与本文研究结果一致。表明沉默PTPRZ1可抑制TGF-β/Smad信号通路,作用于纤维化过程,进而改善大鼠临床症状,抑制病情发展。

综上,口腔黏膜下纤维性变发生后伴随张口受限、胶原生成增加、纤维条索形成等表现,经沉默PTPRZ1干预后可改善上述情况,其机制可能与TGF-β/Smad信号通路被抑制有关。