LncRNA LINC00665通过miR-9-5p调节ATF1表达促进甲状腺乳头状癌进展

赵爱兵 马丽华 窦国章 吴长明 吴双红 李子安 张东伟

(唐山工人医院 1胃肠外二科,河北 唐山 063000;2乳腺外科;3创伤科;4胃肠外一科;5烧伤整形一科)

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,组织病理学分为乳头状癌、滤泡癌、髓样癌和未分化癌〔1,2〕。其中甲状腺乳头状癌(PTC)的发生率已达甲状腺癌总体发生率的80%以上〔3〕,因此研究PTC的发展机制对治疗甲状腺癌意义重大。多数患者经手术和放射性碘治疗后长期总体预后情况较好〔4〕,但仍有一部分患者出现肿瘤复发、转移等情况,仍需再次接受手术治疗。已有多项研究〔5～7〕对PTC的分子机制进行了探索,其中遗传方面的研究成果为PTC的靶向治疗提供了新的见解。LncRNA LINC00665是一种新发现的与肿瘤发展密切相关的LncRNA,在卵巢癌、乳腺癌、肝癌等癌症的发展中起着重要的调控作用〔8～10〕。miR-9-5p能够调控PTC细胞凋亡,抑制PTC细胞活力〔11〕。转录激活因子(ATF)1能够增强甲状腺癌的侵袭能力,与其他肿瘤细胞的增殖、转移及免疫逃逸能力密切相关〔12〕。初步RNA测序分析发现LncRNA LINC00665与miR-9-5p、miR-9-5p与ATF1之间存在能够靶向结合的互补序列,推测LncRNA LINC00665、miR-9-5p、ATF1三者之间存在联系,但目前相关报道较少。本研究分析LncRNA LINC00665、miR-9-5p、ATF1之间的调节关系,对PTC发展的影响。

1 材料与方法

1.1组织标本 收集2019年7月至2020年7月住院进行手术切除的PTC样本80例,术后常规病理诊断结果为PTC。所有患者临床病理资料完整,术前未接受放疗、化疗及生物学治疗。80例PTC患者中男23例,女57例,年龄(45.82±14.27)岁。甲状腺癌TNM分期参照2010年第七版美国癌症联合委员会/国际抗癌联合会制定的分期标准：Ⅰ～Ⅱ期45例,Ⅲ～Ⅳ期35例。收集PTC组织与癌旁组织样本(距离肿瘤≥2 cm),癌旁组织经病理诊断为正常甲状腺组织,于液氮中冻存。

1.2细胞及试剂 TPC-1、KTC-1、B-CPAP细胞株,购自武汉普诺赛生命科技有限公司;HTori-3细胞株,购自上海弘顺生物科技有限公司;Nthy-ori3-1细胞株,购自南京科佰生物科技有限公司;RPMI1640培养基(批号0134802)、胎牛血清(FBS,批号0112417)、链霉素/青霉素(批号0103512)、TRIzol试剂(批号0106471)、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(批号10-205141)、mirVana miRNA分离试剂盒(批号10-064131)、SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物(批号08-513010)、Lipofectamine2000转染试剂(批号096201),购自美国Thermo Fisher公司;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(批号100532104),购自大连宝生生物科技有限公司;All-in-One miRNA qRT-聚合酶链反应(PCR)试剂盒(批号YT20190614),购自亚太恒信生物科技(北京)有限公司;PCR引物与内参购自上海生工生物工程股份有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号20190905)、CCK-8试剂盒(批号20190917)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(批号20190824),购自上海碧云天生物技术有限公司;基质胶(批号YH190811),购自上海研卉生物科技有限公司;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡双染试剂盒(批号0013021504),购自美国BD公司;RIPA试剂(批号010322-500),购自美国Sigma公司;兔ATF1抗体(批号0210036)、兔凝血酶敏感蛋白(TSP)-1抗体(批号0308042)、兔B细胞淋巴瘤基因(Bcl)-2抗体(批号0110327)、兔Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体(批号0110345),购自美国Abcam公司;SP法兔抗体免疫组化试剂盒(批号20191013),购自福州飞净生物科技有限公司。其他试剂均为市售分析纯。

1.3细胞培养、分组与转染 复苏TPC-1、KTC-1、B-CPAP、HTori-3和Nthy-ori3-1,使用含10% FBS和100 mg/ml链霉素/青霉素的RPMI1640培养基进行培养,细胞均放置于设置为37 ℃、5% CO2、饱和湿度的电热恒温培养箱中培养。将生长至对数期的B-CPAP细胞分为对照组(不做转染)、阴性对照组(转染pcDNA3.1空载体和inhibitor-NC)、shLINC00665组(转染pcDNA3.1-shLINC00665)和shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组(转染pcDNA3.1-shLINC00665和miR-9-5p-inhibitor)。将pcDNA3.1-shLINC00665(2 μg)、pcDNA3.1空载体(2 μg)、miR-9-5p-inhibitor(50 nmol/L)和inhibitor-NC(50 nmol/L)用Lipofectamine2000转染试剂按照上述分组进行转染,48 h后收集细胞进行qRT-PCR检测并用于后续实验。

1.4qRT-PCR检测LncRNA LINC00665与miR-9-5p的相对表达 LINC00665检测：TRIzol试剂提取癌、癌旁组织与各组细胞总RNA,用反转录试剂盒转录成cDNA。使用1 μg cDNA模板、上下游引物各0.5 μg和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒配制20 μl PCR体系。反应条件：95 ℃单循环30 s,95 ℃ 40 s,58.5 ℃ 30 s,循环40次。引物序列：LINC00665上游引物：5′-AGCACCCCTAGTGTCAGTCA-3′,下游：5′-TGGTCTCTAGGGAGGCAGAA-3′。内参为GAPDH mRNA;甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游引物：5′-CTCACCGGATGCACCAATGTT-3′,下游：5′-CGCGTTGCTCACAATGTTCAT-3′。miR-9-5p检测：使用mirVana miRNA分离试剂盒提取癌、癌旁组织与各组细胞miRNAs,采用All-in-One miRNA qRT-PCR试剂盒进行检测。反应条件：95 ℃单循环30 s,95 ℃ 40 s,60 ℃ 30 s,循环35次。引物序列：miR-9-5p上游引物：5′-GAGGCAGACAGCCAGACA-3′,下游：5′-CAAGGGTCCGAGGTGG GT-3′。内参为小分子U6 mRNA,U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游：5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′。

1.5双荧光素酶报告基因检测 使用生物信息学数据库TargetScanHuman预测分析了LINC00665、ATF1和miR-9-5p的结合位点,分别构建了野生型和突变型荧光质粒：psiCheck2-LINC00665-Luc、psiCheck2-LINC00665-MUT-Luc;psiCheck2-ATF1-Luc、psiCheck2-ATF1-MUT-Luc,并与miR-9-5p模拟物共转染至B-CPAP细胞中,荧光素酶报告实验检测荧光素酶活性。

1.6CCK-8法检测细胞增殖 取对数生长期的对照组与转染的各组B-CPAP细胞,用胰蛋白酶消化后接种于96孔板上,于37 ℃、5%CO2培养箱中分别培养12、24、48、72、96 h后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,继续培养2 h后用酶标仪检测各孔吸光度。

1.7Transwell检测细胞迁移和侵袭能力 细胞迁移：收集1.4中细胞覆盖率达到80%的对照组与转染的各组B-CPAP细胞,胰酶消化后制成4×105个/ml的单细胞悬液。每组细胞取200 μl悬液均匀接种于Transwell小室上室膜表面,取600 μl含10% FBS的RPMI1640培养基加入下室内。于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h,清除未穿透上室膜表面的细胞,1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,将穿过滤膜的细胞用4%多聚甲醛固定30 min,结晶紫染色。于200倍光学显微镜下观察,每组随机挑选5个视野,计算穿过滤膜的细胞数平均值。细胞侵袭：无血清RPMI1640培养基与基质胶按1∶3的比例稀释,混匀后均匀涂抹于小室上室膜底部,置于37 ℃、5% CO2培养箱中过夜,次日置于紫外线灯下照射30 min。收集1.4中细胞覆盖率达到80%的对照组与转染的各组B-CPAP细胞,胰酶消化后制成5×105个/ml的单细胞悬液。后续操作同细胞迁移。

1.8流式细胞仪检测细胞凋亡 收集1.4中对照与转染并培养48 h的各组B-CPAP细胞,加入结合缓冲液调整细胞浓度为1×106个/ml,每组细胞加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC、5 μl PI,避光反应30 min,在流式细胞仪上进行细胞凋亡检测。

1.9Western印迹检测ATF1、TSP-1、Bcl-2、Bax相对表达 PTC组织与癌旁组织样本匀浆后加入适量预冷RIPA,充分混匀后冰上孵育1.5 h;收集1.4中对照与转染并培养48 h的各组B-CPAP细胞,加入适量预冷RIPA,充分混匀后冰上孵育30 min。组织与细胞均在4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min,取上清液,BCA定量后制样。凝胶电泳分离样品蛋白,转膜,截取目的条带浸于5%脱脂奶粉制成的封闭液中,置于摇床上室温封闭1 h。组织检测ATF1,细胞检测ATF1、TSP-1、Bcl-2和Bax,用封闭液稀释一抗制成孵育液,稀释比例为1∶500,充分摇匀后置于4 ℃环境下过夜。第二天取出膜,平衡至室温后洗膜,加入稀释比例为1∶5 000的对应二抗孵育液,室温孵育2 h,洗膜后加入电化学发光(ECL)液,避光反应5 min,用定量成像仪收集结果。

1.10体内异种移植实验 收集1.4中对照与转染并生长至对数期的各组B-CPAP细胞并制成5×107个/ml的单细胞悬液。裸鼠适应性喂养1 w后随机分为对照组、阴性对照组、shLINC00665组和shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组,每组6只。原位接种细胞悬液于甲状腺被膜下,10周后处死裸鼠,完整取出皮下肿瘤,称重后置于10%甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋并制成切片。

1.11免疫组化染色观察癌组织ATF1表达 采用免疫组化SP法检测裸鼠肿瘤组织ATF1表达。按照试剂盒要求处理石蜡切片并进行染色操作,光镜下拍摄实验结果,每张切片随机选择5个不同视野,用ImageJ软件进行图像分析,取平均值作为ATF1的相对表达量。

1.12统计学方法 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验、方差分析。

2 结 果

2.1LncRNA LINC00665与miR-9-5p在癌、癌旁组织中的表达水平与相关性 qRT-PCR检测结果显示,PTC组织中LncRNA LINC00665相对表达(1.47±0.20)显著高于癌旁组织(0.85±0.09,P<0.05),miR-9-5p相对表达(0.53±0.12)显著低于癌旁组织(0.99±0.09,P<0.05)。相关性分析结果显示,LncRNA LINC00665与miR-9-5p水平呈显著负相关(P<0.05)。见图1。

图1 LncRNA LINC00665与miR-9-5p相关性

2.2LncRNA LINC00665与miR-9-5p在细胞中的相对表达 qRT-PCR检测结果显示,与Nthy-ori3-1相比,PTC细胞中TPC-1、KTC-1、B-CPAP、HTori-3的LINC00665相对表达量均升高,miR-9-5p相对表达量均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。B-CPAP细胞中LINC00665相对表达量最高,因此选择B-CPAP细胞进行后续实验。与对照组相比,shLINC00665组LINC00665相对表达量显著下降,miR-9-5p相对表达量显著上升(P<0.05);与shLINC00665组相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组miR-9-5p表达量显著下降(P<0.05);证明转染成功。见表1、表2。

表1 LINC00665、miR-9-5p在PTC不同细胞系中表达

表2 各组不同时间B-CPAP转染细胞增殖活性及LINC00665、miR-9-5p、ATF1表达比较

2.3ATF1在癌、癌旁组织和细胞中的表达 与癌旁组织(0.79±0.04)相比,PTC组织中ATF1相对表达量(1.53±0.11)显著升高(P<0.05);与对照组相比,shLINC00665组、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组ATF1相对表达量显著下降(P<0.05)。见表2、图2。

1～6：癌旁组织、PTC组织、对照组、阴性对照组、shLINC00665组、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组图2 ATF1在癌、癌旁组织和细胞中表达

2.4双荧光素酶报告基因检测结果 TargetScanHuman在线数据库结果显示,LncRNA LINC00665与miR-9-5p存在结合位点,ATF1与miR-9-5p存在结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果表明,miR-9-5p模拟物能够明显降低野生型3′非翻译区(UTR)的LINC00665荧光素酶活性(P<0.05),对突变型3′UTR的LINC00665荧光素酶活性无明显影响(P>0.05),说明LncRNA LINC00665能够直接靶向作用于miR-9-5p;能够明显降低野生型3′UTR的ATF1荧光素酶活性(P<0.05),对突变型3′UTR的ATF1荧光素酶活性无明显影响(P>0.05),说明miR-9-5p能够直接靶向作用于ATF1。见图3、表3。

表3 两组LINC00665相对荧光素酶活性

图3 LncRNA LINC00665靶向调控miR-9-5p及miR-9-5p靶向调控ATF1双荧光素酶报告基因检测结果

2.5LINC00665通过调控miR-9-5p促进PTC细胞增殖、迁移和侵袭并抑制凋亡 CCK-8检测结果显示,与对照组相比,shLINC00665组72、96 h细胞增殖活性明显降低(P<0.05);与shLINC00665组相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组72、96 h细胞增殖活性显著上升(P<0.05)。见表2。Western印迹结果显示,与对照组相比,shLINC00665组、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组TSP-1、Bax表达量显著上升,Bcl-2表达量显著下降(P<0.05);与shLINC00665组相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组TSP-1、Bax表达量显著降低,Bcl-2表达量显著升高(P<0.05)。见图4、表4。Transwell细胞迁移与侵袭实验结果显示,与对照组相比,shLINC00665组、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组细胞迁移与侵袭能力明显下降(P<0.05);与shLINC00665组相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组细胞迁移与侵袭能力显著增强(P<0.05)。见表4、图5。凋亡结果显示,与对照组相比,shLINC00665组、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与shLINC00665组相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见表4、图6。

表4 各组细胞凋亡率、迁移、侵袭细胞数及TSP-1、Bcl-2和Bax相对表达水平

1～4：对照组、阴性对照组、shLINC00665组、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组图4 Western印迹检测各组TSP-1、Bcl-2和Bax表达量

图6 miR-9-5p对各组细胞凋亡的影响

2.6LncRNA LINC00665促进PTC发展 体内异种移植实验结果显示,与对照组相比,shLINC00665组肿瘤生长速度明显下降(P<0.05);与shLINC00665组相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组肿瘤生长速度明显提高(P<0.05)。免疫组化检测结果显示,与对照组(1.54±0.26)和阴性对照组(1.47±0.22)相比,shLINC00665组(0.54±0.13)、shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组肿瘤ATF-1相对表达水平(0.62±0.10)明显下降(P<0.05)。见图7、图8、表5。

表5 各组不同时间皮下肿瘤体积比较

图7 各组皮下肿瘤大体形态

图8 各组皮下肿瘤组织病理(免疫组化,×200)

3 讨 论

LncRNA是长度超过200个核苷酸序列的非编码RNA分子,具有调控蛋白质功能、基因印记、转录等多种生物学功能〔13〕。研究〔14〕表明LncRNA的表达或功能异常与人类疾病的发生密切相关,在许多癌症的发生发展过程中,lncRNA已成为新的治疗目标及诊断和预后标志物。本研究结果提示,LncRNA LINC00665与PTC的发展相关且LINC00665参与调控了B-CPAP细胞的增殖、迁移与侵袭,并抑制了B-CPAP细胞凋亡。研究〔15〕发现某些肿瘤细胞与特定组织中,一些lncRNA能够携带某些miRNA的“种子序列”,像海绵一样结合miRNA,从而阻止miRNA与其靶mRNA结合。本研究通过生物信息学数据库TargetScanHuman预测分析发现LINC00665与miR-9-5p存在结合位点,双荧光素酶报告基因检测也证实了LINC00665与miR-9-5p之间能够发生相互作用,且LINC00665能够抑制miR-9-5p表达,促进PTC发展。

miRNA是一类内源性小分子非编码RNA,通过与靶基因3′UTR互补配对结合调节靶基因mRNA降解或抑制基因表达〔16〕。相关研究〔17,18〕发现miR-9-5p在胃癌、前列腺癌等癌症中发挥抑制作用。本研究推测miR-9-5p在PTC中同样发挥抑制作用。本研究结果说明,miR-9-5p能够抑制B-CPAP细胞增殖、迁移与侵袭,促进B-CPAP细胞凋亡。ATF1是环磷酸腺苷(cAMP)应答元件结合蛋白家族中的一员,其结构与功能和部分肿瘤的发生发展密切相关〔19〕。ATF1具有促进肿瘤细胞增殖、转移、侵袭与免疫逃逸,抑制肿瘤细胞凋亡的能力〔20〕。Peng等〔21〕研究发现ATF1能够改变Bcl-2/Bax的比值,抑制胃黏膜上皮细胞凋亡信号转导通路,促进胃癌发生。TSP-1能够抑制与血管生成相关的蛋白质,通过调节血管生成等影响肿瘤侵袭〔22〕。ATF1与TSP-1启动子中cAMP反应元件结合位点相作用,可使肝细胞生长因子诱导的TSP-1表达下调,进而导致甲状腺癌细胞侵袭性增强。本研究中TSP-1、Bcl-2与Bax的Western印迹检测结果与上述研究结论相近,说明ATF1对PTC发展具有促进作用。