miR-137通过靶向MCL1和谷氨酰胺转运SLC1A5调节肺癌细胞的铁死亡机制

曹西迎 谢春发 吴志诚 章祖雄 钟炜祥 黄明登

(赣南医学院第一附属医院心胸外科,江西 赣州 341000)

非小细胞肺癌(NSCLC)是人类常见的恶性肿瘤,占所有肺癌病例的80%～85%〔1〕。由于其复杂的发病机制和不清楚的分子机制,目前对NSCLC的治疗受到很大限制。解决此问题的方法是阐明NSCLC进展的潜在机制。铁死亡是一种新发现的非凋亡性细胞死亡方式,涉及代谢功能异常,导致细胞内代谢过程谷氨酰胺分解及产生铁依赖性活性氧(ROS)、铁载体蛋白转铁蛋白和线粒体超氧化物(MitoSOX)及膜电位减少并形成其他相关的调控因子,铁和铁衍生物在ROS酶的产生过程中发挥重要作用,表明铁可能充当细胞死亡信号的触发或介体,特别是在铁死亡中,含铁酶对于铁死亡必不可少〔2～4〕。据报道,miR-137在多种癌症的发展中起抑癌作用,包括胰腺癌、大肠癌和NSCLC〔5〕。值得注意的是,miR-137通过靶向类固醇受体共激活子(SRC)3减慢人类NSCLC的细胞增殖,并通过下调骨形态发生蛋白7抑制NSCLC细胞迁移〔6〕。谷氨酰胺转运蛋白溶质载体家族A1成员(SLC1A)5对于L-谷氨酰胺的转运和代谢至关重要,L-谷氨酰胺对癌细胞的生长至关重要,研究人员证实SLC1A5通过促进谷氨酰胺代谢来促进癌症的发展〔7〕。SLC1A5参与了NSCLC进程的调控,而SLC1A5的失活则通过减少L-谷氨酰胺的消耗而抑制了NSCLC细胞的活力〔8〕。此外,SLC1A5的上调促进了甲状腺乳头状癌的细胞迁移和侵袭〔9〕,且SLC1A5可以被多种miRNA抑制。具体而言,SLC1A5被证明是miR-137的下游靶标,并参与黑色素瘤中肿瘤细胞死亡的调控〔10〕。髓系白血病1蛋白(MCL1)是主要的抗凋亡B细胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白,半衰期非常短,其在各种人类癌症中的过表达表明,MCL1表达的增加有助于癌变,并导致细胞凋亡的抑制〔11〕。有研究证明MCL1是miRNA作用的直接靶标,并在癌症的发展中有促进作用〔12〕。上述文献显示,miR-137可能通过依赖性的方式调节NSCLC细胞中SLC1A5和MCL1的水平,参与细胞铁死亡,但是其详细机制未知。本研究探讨miR-137通过靶向MCL1和谷氨酰胺转运体SLC1A5调节肺癌细胞的铁死亡机制。

1 材料和方法

1.1细胞培养 NSCLC细胞系A549从美国典型培养物保藏中心(ATCC,USA)获得。在RPMI1640培养基(HyClone,UT)中培养以上细胞,并在标准培养条件(5%CO2,37 ℃)下孵育。所有培养基补充10%胎牛血清(FBS)。

1.2siRNA、miRNA模拟物和质粒转染 培养细胞以进行载体转染,直至细胞融合度达到70%～80%。由Sangon Biotech(中国上海)设计和合成miR-NC,miR-137模拟物(5′-GGATCAAGATTGCAT-3′;5′-UUACAUGCGAUUACGUACAAUUGA-3′)和miR-137的小干扰RNA(siRNA),以敲除miR-137,用于构建载体的siRNA序列如下：正义(5′-GGATCAAGATTGAAGCAT-3′)和反义(5′-UUACAUGCGAUUACG UACAAUUGA-3′)。使用LipofectamineTM2000转染试剂(10 nmol/L)递送至A549细胞。转染后48 h,准备细胞用于分析。

1.3实验分组 根据实验要求,将细胞分为对照组(肺癌细胞系A549规培条件下培养,用于对照实验)、miR-137转染组(构建miR-137转染的A549细胞)、miR-137沉默组(构建miR-137小干扰RNA质粒转染A549)。

1.4实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 将质粒转染的和未处理的对照细胞(1×104细胞/样品)接种到96孔板中。为了研究MCL1和SLC1A5、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)4 mRNA表达水平的变化,根据生产商的规程,使用TaqMan®基因表达细胞-CTTM试剂盒进行RT-qPCR。条件：37 ℃孵育60 min,95 ℃孵育5 min。RT-qPCR使用Applied Biosystems7500快速实时PCR系统进行。使用TaqMan基因表达预混液和以下TaqMan基因表达测定法(探针和引物)扩增靶mRNA。RT-qPCR热循环条件如下：在50 ℃下初始变性2 min,在95 ℃下变性10 min,在95 ℃下进行40次循环变性15 s,在60 ℃下进行1 min变性。使用2-ΔΔCt方法计算靶mRNA表达水平。

1.5双荧光素酶报告基因系统 使用在线StarBase软件预测SLC1A5 mRNA的miR-137,MCL1和3′非翻译区(UTR)区域的结合位点。分别对MCL1和SLC1A5 mRNA的一种特异性结合序列进行突变。Sangon Biotech(中国上海)将野生型(Wt)和突变体(Mut)MCL1和SLC1A5 mRNA克隆到pmiRGLO表达载体中。使用LipofectamineTM2000转染试剂,按照制造商的规程,将上述miR-NC(5 nmol/L)和miR-137模拟物(5 nmol/L)与上述载体(5 nmol/L)共转染到A549细胞中。24 h后,通过双重荧光素酶报道基因系统确定细胞中的相对荧光素酶活性。

1.6铁测定 使用铁测定试剂盒测量每个细胞系中的Fe2+。首先,将2×106的细胞在4～10体积的铁测定缓冲液中快速匀浆。将样品在4 ℃于5 000 r/min离心10 min,以除去不溶物。为了测量二价铁,向每个孔中加入5 μl铁测定缓冲液。在一组孔中将5 μl的测定缓冲液添加到样品中,在另一组孔中添加5 μl的铁还原剂。使用水平摇床或通过移液器将样品充分混合,并将反应在室温黑暗条件下孵育30 min。将100 μl铁探针添加到每个装有标准品或测试样品的孔中。使用卧式摇床或移液器将样品充分混合,将反应在室温黑暗条件下孵育60 min。最后在593 nm(A593)处测量吸光度。

1.7线粒体膜电位测量 为了使用线粒体膜电位试剂盒MAK-159测量线粒体膜电位,将5×104细胞接种在90 μl的黑色96孔板中,该板在无酚红的培养基中具有清晰的碱基,并在第二天进行处理加入二甲基亚砜(DMSO)或10 μmol/L的蛋白。孵育48 min后,将50 μl缓冲液A(1/100)中的JC-10染料添加到细胞中,并孵育60 min,添加50 μl缓冲液B。在微板读取器上读取板。监测荧光强度水平(λex= 490/λem= 525 nm)和(λex=540/λem=590 nm)以进行比率分析。红色/绿色荧光强度的比率用于确定线粒体膜电位。

1.8MitoSOX的测量 使用用于活细胞成像的MitoSOXTMRed指示剂(专门设计用于MitoSOX的荧光探针)测量了细胞中MitoSOX的产生。将50 μg的MitoSOX指示剂溶解在13 μl的DMSO中,形成5 μmol/L的MitoSOX试剂储备液。在Hank的盐缓冲液/钙(Ca)/镁(Mg)缓冲液中稀释5 μmol/L MitoSOX试剂原液,制成5 μm MitoSOX试剂工作液。应用2.0 μml的5 μmol/L MitoSOX试剂工作溶液,以覆盖黏附在盖玻片上的细胞。将细胞在黑暗条件下于37 ℃孵育30 min。将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻漂洗3次。细胞荧光在倒置荧光显微镜下以510/580 nm的激发/发射值进行检查。用ImageJ软件定量荧光强度。结果表示为相对于对照标准化的相对荧光强度水平。

1.9脂质过氧化评估 根据荧光定量酶标仪,使用荧光读板仪和6-羧基-2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯染料检测细胞内ROS水平。根据制造商的规程,使用丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建城生物工程研究所,南京)来检测脂质过氧化水平。使用氧化型谷胱甘肽(GSSG)/还原型谷胱甘肽(GSH)定量试剂盒确定SFN(20 μmol/L)处理96 h和未处理的细胞(5×106细胞/样品)中的总GSH水平。使用Multiskan GO微板分光光度计在405 nm处测量每个样品的吸光度。使用GraphPad Prism软件从校准曲线获得GSH浓度。总共进行3个独立的重复。

1.10流式细胞仪分析细胞凋亡 将细胞以1×105细胞/孔的密度在37 ℃下接种到24孔板中96 h。根据制造商的说明,使用用于哺乳动物细胞分析的LIVE/DEADTM活力/细胞毒性试剂盒测量细胞毒性。钙黄绿素-AM保留在活细胞中,产生绿色荧光,而乙二胺均二聚体(EthD)-1进入具有受损膜的死细胞并与核酸结合,产生红色荧光。根据初步实验,使用浓度为50 μmol/L钙黄绿素-AM和4 μmol/L EthD-1溶液(数据未显示)。使用流式细胞仪和Kaluza软件进行分析。

1.11Transwell测定NSCLC细胞侵袭能力 为了进行迁移测定,将5×105细胞接种到Transwell培养板(Corning,中国上海)的上腔室中。将添加了15%FBS的培养基放入下腔室。为了进行侵袭测定,用基质胶(目录号356234,康宁)溶液包被Transwell室。将约5×105细胞(200 μl)接种到板的上腔室中,并将含15%FBS(600 μl)的培养基放入下腔室中。分别孵育24或48 h以进行迁移或侵袭试验后,将渗透到膜下表面的细胞用4%多聚甲醛固定60 min,用结晶紫染色80 min并计数。

1.12TUNEL测定相关载体转染的NSCLC凋亡细胞 用试剂盒提供的二氨基联苯胺(DAB)反应混合物对细胞进行染色。核DNA用4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。用光学显微镜观察TUNEL阳性细胞以评估细胞凋亡。通过使用ImageJ软件定量NSCLC细胞的凋亡率。

1.13统计学分析 采用GraphPad Prism软件进行配对或不配对的学生t检验或Mann-WhitneyU检验及单向或双向方差分析,采用Tukey的事后多重比较法。

2 结 果

2.1miR-137调控MCL1、SLC1A5和GPX4的mRNA表达 RT-qPCR结果显示,miR-137沉默组较miR-137转染组和对照组MCL1、GPX4和SLC1A5 mRNA表达显著升高(P<0.05),miR-137转染组较对照组上述指标表达显著降低(P<0.05),表明MCL1、SLC1A5和GPX4表达受到miR-137调控。见图1、表1。

表1 各组MCL1、SLC1A5和GPX4的mRNA表达

图1 各组MCL1、SLC1A5和GPX4 mRNA表达

2.2双重荧光素酶测定 双重荧光素酶报告结果显示,与对照组相比,miR-137转染组显著降低了Wt-SLC1A5和Wt-MCL1载体共转染的NSCLC细胞中的荧光素酶活性(P<0.05),而Mut-SLC1A5和Mut-MCL1模拟共转染荧光素酶活性酶未发生显著变化(P>0.05),说明miR-137靶向调控MCL1和SLC1A。见表2。

表2 荧光素酶测定miR-137与MCL1和SLC1A的靶向作用

2.3miR-137过表达促进细胞铁死亡 miR-137沉默组较miR-137转染组和对照组Fe2+浓度、MitoSOX浓度显著降低,线粒体相对膜电位显著升高(P<0.05);miR-137转染组较对照组Fe2+浓度、MitoSOX浓度显著升高,线粒体相对膜电位显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组细胞铁吸收、线粒体功能评估及脂质氧化反应水平检测

2.4miR-137对细胞铁下垂的调控 miR-137沉默组较miR-137转染组和对照组ROS和MDA浓度显著降低,GSH浓度显著升高(P<0.05);miR-137转染组较对照组ROS和MDA浓度显著升高,GSH浓度显著降低(P<0.05)。说明miR-137参与细胞的铁诱导死亡程序。见表3。

2.5细胞迁移、侵袭能力检测 Transwell结果显示,miR-137沉默组较miR-137转染组和对照组细胞迁移、侵袭数量显著增多(P<0.05),miR-137转染组较对照组细胞迁移、侵袭数量显著减少(P<0.05)。见图2、表4。

表4 各组细胞凋亡率、迁移及侵袭数量比较

图2 各组细胞迁移、侵袭(结晶紫染色,×200)

2.6细胞凋亡分析 流式细胞仪检测细胞凋亡,24、48和72 h检测发现miR-137转染组较miR-137沉默组和对照组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),72 h时miR-137沉默组较对照组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见表4、图3。

图3 TUNEL分析各组细胞凋亡水平(DAPI染色,×200)

3 讨 论

近年来,科学家们意识到除凋亡外的细胞死亡可用于消除癌细胞。进一步研究确定了其中的一些死亡,例如烧伤、程序性坏死和铁死亡。科学家们揭示了铁减少症的参与消除了对抗癌药物具有抗性的癌细胞,尽管其具体机制尚不清楚。其他研究发现,某些传统药物可能以自噬依赖性方式触发胶质母细胞瘤的细胞死亡,这表明铁死亡可以作为一种有效的方法治疗癌症〔13〕。由于铁死亡的功能主要取决于ROS,而ROS受多种因素调节,例如铁水平、还原型GSH水平和脂质过氧化水平〔14〕。铁死亡是一种最近定义的调节型细胞死亡类型,在形态学、遗传学和生物化学方面不同于其他类型的细胞死亡。在正常细胞和癌细胞之间的各种差异中,癌细胞的一个显著特征是即使在存在氧气的情况下也切换到厌氧代谢,这被称为Warburg效应〔15〕。在各种癌症中的观察表明,随着三羧酸循环(新陈代谢中的关键氧化循环)的显著变化,细胞的新陈代谢也发生了变化。铁是一种至关重要的金属元素,对于细胞复制、新陈代谢和生长是必不可少的。其中脂质过氧化作用是由游离细胞内铁引发的以碳和氧为中心的自由基介导的〔16〕。亚铁在与过氧化氢的反应中提供电子,产生羟基自由基,一种ROS。这种反应不仅会损害脂质和蛋白质,还会对DNA造成氧化损害。线粒体是重要的细胞器,参与能量代谢、细胞信号传导和细胞死亡途径调控,包括铁死亡。此外,线粒体的凝缩、线粒体内质网的减少和线粒体尺寸的减少在形态学上被描绘成铁死亡。导致肥大细胞死亡的两个主要因素是游离铁增加和脂质过氧化物积累〔17〕。雌铁蛋白诱导的铁蓄积可通过铁螯合、抗氧化剂或细胞铁摄取的遗传抑制来避免,其可促进ROS的产生,从而导致脂质过氧化和随后的死亡。本研究结果说明,线粒体参与了miR-137/SLC1A5/MCL1轴对细胞铁死亡的调控。

miR-137可以作为抑制NSCLC发生的肿瘤抑制因子〔18〕,这一点在本研究中也得到了证实。在细胞系A549中观察到低表达的miR-137,而miR-137过表达抑制了NSCLC细胞的活力和迁移,并促进细胞凋亡,而miR-137的下调促进了NSCLC细胞的活力和迁移,这暗示miR-137的上调会阻碍NSCLC在体外的发育〔18〕。一致地,这项研究证实了miR-137负调控MCL1和SLC1A5,本研究证明了miR-137通过下调MCL1和SLC1A5来调节NSCLC细胞功能。从机制上讲,上调miR-137对促进NSCLC细胞铁死亡和侵袭的抑制作用均可以通过敲低miR-137而逆转,表明miR-137通过下调MCL1和SLC1A5抑制了NSCLC中的恶性表型。铁死亡是由细胞GSH依赖的抗氧化剂防御系统失活触发的,导致铁依赖的有毒脂质ROS的积累。铁死亡是铁依赖性的非凋亡调控形式的细胞死亡,可被铁螯合剂DFO抑制。但是,肥大症在SCLC细胞中的作用尚不清楚。本研究结果表明,MCL1和SLC1A5参与了SCLC细胞的铁死亡。

SLC1A5和MCL1参与了癌症进展的调控,其调控癌细胞的生长和迁移率〔19〕。值得注意的是,先前的数据表明SLC1A5可以促进NSCLC细胞增殖和转移,这在本研究中得到了验证〔20〕。具体而言,通过分析临床标本中SLC1A5的表达模式,本文发现SLC1A5参与了细胞铁死亡的机制。作为人类癌症中最常见的扩增基因之一,MCL1过表达已被确定与高肿瘤分级和患者生存率降低相关〔21〕。研究表明,MCL1可能参与肿瘤细胞铁死亡的凋亡机制,在抗肿瘤中起关键作用,这对于发展抗癌性很重要〔22〕。本研究证明了SLC1A5和MCL1是miR-137的下游靶标,而miR-137沉默则上调SLC1A5以增强肿瘤谷氨酰胺代谢。正如预期结果,证明miR-137可以作为转录后调节剂,通过靶向其3′非翻译区(UTR)使SLC1A5和MCL-1沉默,并通过miR-137海绵化。作为铁死亡的重要成员,GPX4可以消除ROS。在许多研究中,科学家将调节GSH水平的药物定义为Ⅰ类促铁死亡诱导剂,将影响GPX4活性的药物定义为Ⅱ类育肥性诱导剂。本研究发现,miR-137可以影响肺癌细胞中GPX4的表达水平,并揭示了GPX4在铁死亡中的作用。在先前的研究中,发现GPX4促进神经胶质瘤细胞的生长。本研究发现,在肺癌细胞中降低GPX4可诱导的铁死亡并不新鲜,因为已确认GPX4是铁死亡的抑制剂。

综上所述,上调miR-137可以沉默SLC1A5和MCL1,诱导肺癌细胞铁死亡引起的细胞凋亡而表现出抗癌作用。