盐酸氨溴索对脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺血管重塑的改善作用及机制

饶习敏 顾延会 刘晓丽 张兰英 欧阳瑶

(遵义医科大学附属医院呼吸与危重症学科,贵州 遵义 563000)

急性肺损伤(ALI)是指肺部疾病进展至功能衰退的病理环节〔1〕。在病理性发展中,内毒素能够促进机体生成大量炎性因子,炎性因子与效应细胞相互作用会导致弥漫性炎性肺泡浸润及肺血管壁增厚〔2〕。若未及时得到有效治疗,极易引发肺组织纤维化、肺衰竭危及生命,但临床尚未明确ALI的具体发病机制〔3〕。盐酸氨溴索是常见祛痰药,在化痰、改善呼吸方面具有良好的临床效果。据报道〔4〕,盐酸氨溴索能够抑制肺组织炎性应激反应,平衡细胞凋亡和增殖,从而减轻肺组织损伤。肺部是革兰阴性细菌引发的脓毒症极易损伤的器官,表现为ALI,是导致患者死亡的主要原因。临床认为ALI病理反应过程中革兰阴性细菌的脂多糖(LPS)发挥出关键作用〔5〕。研究发现〔6〕,LPS诱导ALI后,肺部因炎症反应会释放白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-13等多种细胞因子,影响肺动脉平滑肌细胞的增殖、凋亡等生理状态,而肺动脉平滑肌细胞凋亡是诱发肺血管重塑的基础。目前盐酸氨溴索与ALI血管重塑的相关性未见文献报道。本研究探讨盐酸氨溴索对LPS诱导的ALI大鼠肺血管重塑的改善作用及机制。

1 材料和方法

1.1实验动物、试剂和仪器 实验动物：选取医院动物实验中心提供的80只8～10周龄SPF级成年SD大鼠,动物合格证号：SYXK(京)2019-0096,平均体质量(240±200)g,大鼠均于SPF级环境中饲养,饲养环境通风良好,温度(25±2)℃,湿度40%～60%,大鼠饮食不设限制,熟悉环境1 w后,第2周开始展开实验流程。大鼠相关操作流程均获得医院实验动物管理伦理委员会批准(批准号：2019-032)。主要试剂：盐酸氨溴索口服溶液购自上海勃林格殷格翰药业有限公司,地塞米松(DXMS)购自湖北天药药业股份有限公司,LPS、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)和血管内皮生长因子(VEGF)、胱天蛋白酶(Caspase)-3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)和Bcl-2抗体、兔抗磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 抗体均购自美国Santa公司,Western印迹试剂盒(美国R&D公司),免疫组化试剂盒、弹力纤维(EVG)染色试剂盒购自江苏绿叶生物科技有限公司,蛋白浓度测定试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)化学发光试剂盒均购自英国Abcam。主要仪器：冰箱购自海尔公司,台式低温高速离心机购自美国Thermo公司,化学发光凝胶成像仪购自北京君意东方电泳公司,LeicaRM2135组织切片机购自德国Leica公司。

1.2构建ALI大鼠模型及分组 大鼠常规喂养7 d后,采用随机数字法分为正常组、模型组、盐酸氨溴索处理ALI组(实验组)、阳性对照药地塞米松(DXMS)处理组(阳性组)各20只。除正常组外,其余各组尾部静脉注射5 mg/kg的LPS构建ALI模型,注射剂量0.5 ml,正常组给予等体积的生理盐水;大鼠模型完成后,每日分别在实验组和阳性组大鼠皮下注射1 ml、规格为20 mg/kg的盐酸氨溴索和DXMS,连续给药28 d,正常组、模型组分别注射与实验组和阳性组等量的生理盐水。完成注射后,大鼠自由饮食,不加限制。

1.3检测各组呼吸功能 给药结束后次日分别在特定描记箱中的大鼠昏迷和清醒状态时采用动物肺功能测定仪测定潮气量、呼吸频率及每分钟通气量,期间需运行IOX软件。

1.4苏木素-伊红(HE)染色观察各组肺组织病理学改变 全部大鼠测定肺功能结束后,通过颈椎脱臼处死大鼠,解剖取大鼠肺组织,在-80 ℃冰箱中放置90%肺组织待检测。另外用10%多聚甲醛液固定剩余10%肺组织24 h,石蜡切片,摊、烤完成后展开HE染色,封片后采用光学显微镜观察肺组织病理学变化。

1.5EVG染色检测各组肺组织肺血管重塑 取出各组部分肺脏组织,固定,石蜡包埋,脱蜡,灭菌常规10 min清洗,EVG染色肺部组织15 min,荧光显微镜倒置并辅助Image Pro Plus8.0软件观察肺组织肺血管重塑情况。血管中膜厚度占比：每组选取10～15根肺小动脉,直径均为25～100 μm,分别测定血管内径和外径厚度,计算相对中膜厚度(%)=〔(血管外径-血管内径)/血管外径〕×100%〔7〕。

1.6TUNEL染色检测各组肺动脉平滑肌细胞的凋亡 取部分肺组织,固定完成后,冰冻切片,二甲苯重复清洗2次,梯度酒精反复冲洗5 min,脱水后利用H2O2-甲醇进行10 min浸泡,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗15 min,后在预冷酒精溶液中缓冲液预处理2 min,PBS冲洗15 min,加入TUNEL反应溶液,避光加封口膜1 h,PBS冲洗,脱水,透明,封片,显微镜观察肺动脉平滑肌细胞凋亡情况,并拍照。正常平滑肌细胞遇TUNEL反应溶液细胞核呈蓝色,反之呈棕黄色,用400倍镜观察并计算肺动脉凋亡平滑肌细胞百分数。

1.7免疫组化检测肺组织中α-SMA、VEGF蛋白表达及血管肌化程度 PBS冲洗脱蜡及水化完成后的肺组织切片,利用PBS高压修复脱蜡、水化完成后的切片组织,然后用3% H2O2室温下浸泡以阻断内源性过氧化物酶,封闭后分别加稀释好的一抗4 ℃过夜孵育,第2天恢复室温后PBS冲洗,加入稀释完成的二抗,室温下30 min孵育,PBS冲洗。加入DAB继续孵育5 min,加入去离子水中断孵育,加入苏木素染色,无菌水充分清洗后,梯度酒精反复冲洗2 h,脱水完成后,去除组织表面液体,透明、封片,利用光学显微镜观察其形态并摄片。依据参考文献〔8〕方法评估阳性细胞程度,利用10个高倍镜视野(×200)光学显微镜下观察切片中阳性细胞数,每个视野取200个细胞观察阳性占比,阳性细胞染色程度评分：未染色为0分,淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。阳性细胞计分：无阳性细胞为0分,1%～10%阳性细胞为1分、11%～50%阳性细胞为2分,51%～75%阳性细胞为3分,>75%阳性细胞为4分。免疫组化染色结果为阳性细胞染色程度评分与阳性细胞计分的乘积。

血管肌化程度：观察α-SMA免疫组化切片组织,用10个高倍视野观察切片血管肌化程度,选择15～50 μm直径的肺小动脉,肌化判定标准：切片血管壁α-SMA 染色呈阳性,α-SMA染色阳性占比>75%定义为全部肌化,血管全部肌化占比=全部肌化血管数/观察血管总数×100%〔9〕。

1.8线粒体膜电位变化情况检测 取肺组织加入组织裂解液后,根据线粒体/胞质制备试剂盒说明书步骤,提取线粒体。根据试剂盒步骤说明加入500 μl线粒体膜电位试剂盒(JC-1)染色工作液,37 ℃下孵育20 min后再用JC-1染色工作液清洗2次,用共聚焦荧光显微镜观察波长对细胞显色水平的影响,膜电位变化可通过ImageJ软件重叠红、绿荧光,以红、绿色荧光光密度比值得出。

1.9Western印迹检测各组肺组织中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平 取出各组肺组织,加入裂解液,离心取上清,电泳后,加入一抗(1∶1 500),二抗(1∶1 500)稀释后,显色30 min,完成曝光、显影、定影后,参照GAPDH分析肺组织中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析蛋白条带积分光密度(IOD)值,以靶蛋白与GAPDH 的IOD值比值表示靶蛋白的相对表达水平。

1.10统计学分析 采用SPSS16.0软件行t检验。

2 结 果

2.1各组呼吸功能比较 模型组呼吸频率明显高于正常组,通气量和潮气量明显低于正常组(P<0.05);实验组、阳性组呼吸频率明显低于模型组,通气量和潮气量明显高于模型组(P<0.05),实验组和阳性组以上指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组呼吸功能比较

2.2各组肺组织病理学观察 正常组肺组织完整,肺泡腔结构清晰且完整,肺泡健康排列,无水肿、炎性因子分泌、渗出分泌物等现象。模型组气道及毛细血管周围存在大量炎性因子浸润,肺泡壁排队不规则,管腔狭窄,血管壁不合理增厚。实验组及阳性组阳性因子浸润较模型组好转,肺组织病理症状减轻。见图1。

图1 各组肺组织病理学(HE染色,×200)

2.3EVG染色观察各组肺组织血管重塑 正常组肺组织血管结构正常,无异常管壁增厚。模型组肺小动脉中膜厚度增加比例〔(54.92±5.73)%〕高于对照组〔(10.02±1.28)%〕,差异具有统计学意义(t=34.201,P<0.001)。而实验组〔(23.45±4.85)%〕、阳性组肺小动脉中膜厚度增加比例〔(25.82±5.02)%〕小于模型组,差异具有统计学意义(t=18.748、17.083,均P<0.001)。实验组和阳性组差异无统计学意义(t=1.518,P=0.137)。见图2。

图2 各组肺组织血管重塑(EVG染色,×400)

2.4免疫组化检测各组肺组织中α-SMA和VEGF蛋白表达 模型组肺组织α-SMA和VEGF蛋白表达及血管肌化程度明显高于正常组(P<0.05),实验组、阳性组肺组织α-SMA和VEGF表达及血管肌化程度明显低于模型组(P<0.05);实验组和阳性组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。

表2 各组肺组织中α-SMA、VEGF阳性表达评分和血管肌化程度比较

2.5TUNEL染色检测各组肺动脉平滑肌细胞的凋亡 模型组肺动脉平滑肌细胞凋亡率〔(48.32±6.79)%〕明显高于正常组〔(9.85±2.42)%;t=23.867,P<0.001〕,实验组〔(31.06±7.48)%〕、阳性组肺动脉平滑肌细胞的凋亡率〔(26.54±8.12)%〕明显低于模型组(t=7.641、9.202,均P<0.001)。实验组和阳性组差异无统计学意义(t=1.831,P=0.075)。见图4。

图4 各组肺动脉平滑肌细胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.6Western印迹检测各组肺组织中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达 模型组肺组织Caspase-3、Bax蛋白表达明显高于正常组,Bcl-2蛋白表达明显低于正常组(P<0.05);实验组和阳性组肺组织中Caspase-3、Bax蛋白表达明显低于模型组,Bcl-2蛋白表达明显高于模型组(P<0.05);实验组和阳性组差异无统计意义(P>0.05)。见图5、表3。

图5 各组肺组织中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达

表3 各组肺组织中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白相对表达量比较

2.7线粒体膜电位变化 正常组中细胞线粒体膜电位〔红色荧光与绿色荧光比值(28.63±7.45)%〕处于低水平,模型组细胞线粒体膜电位〔(80.05±12.37)%〕较正常组明显增加(t=15.925,P<0.001),实验组〔(55.24±10.83)%〕、阳性组线粒体膜电位〔(56.79±15.28)%〕明显低于模型组(t=6.749、5.291,均P<0.001),实验组和阳性组差异无统计学意义(t=0.370,P=0.703)。见图6。

图6 各组细胞线粒体膜电位比较(JC-1染色,×400)

3 讨 论

ALI是临床常见疾病,其致病因素较多,包括感染、休克、肺挫伤等外界因素引发肺部毛细血管功能损伤,导致大鼠肺小动脉中膜厚度增加、呼吸受限〔10〕。ALI病情复杂,且进展迅速,临床上救治的关键是及时缓解症状,若病情不加以控制极易进展为呼吸衰竭,甚至随时危及患者生命安全,但目前针对ALI尚缺乏有效的救治手段,因此明确ALI的发病机制是临床危重病学领域亟待解决的问题之一。本研究结果说明模型构建成功,可用于进一步实验研究。

盐酸氨溴索作为一种黏液调节剂在临床上应用多年,已有不少研究证实〔11〕,盐酸氨溴索可通过抗氧化、减轻炎症介质促进肺表面活性中磷脂合成等作用发挥对ALI的保护作用。本研究结果与既往研究结果相符。然而与ALI过程有关的机制众多,研究表明〔12〕,肺血管重塑在ALI的发生、发展中发挥重要作用。本研究结果说明,LPS诱导的ALI大鼠肺血管重塑病症明显。研究发现〔13〕,肺血管重塑是呼吸系统中复杂的生理过程,由众多因素参与,α-SMA和VEGF在这一过程中发挥了重要作用。α-SMA作为肌动蛋白的一种,具有收缩能力并且富含大量微丝的胞内蛋白,可以调控肺血管平滑肌细胞的表型转换〔14〕,α-SMA表达量可以有效反映ALI肺部纤维化程度〔15〕。据报道〔16〕,作为血管内皮细胞生长的促进因子,VEGF可表达于肺平滑肌细胞,并参与多条信号通路信号传导,是平滑肌细胞增殖、迁移的重要参与者,也是ALI大鼠肺动脉发生重塑的关键。本研究结果说明,盐酸氨溴索对ALI大鼠肺部的保护作用可能与改善肺部血管重塑状态有关。

研究表明〔17〕,细胞凋亡与肺细胞血管重塑紧密相关,激活凋亡基因能够促进平滑肌细胞凋亡进而排出体外,细胞增殖有利于修复受损的肺组织,实现细胞增殖和凋亡的平衡,从而保障血管壁细胞健康。而一旦细胞凋亡与增殖的平衡被破坏,肺血管细胞大量增殖且细胞凋亡速率减弱,会导致细胞大量累积,进而出现血管重塑。本研究结果说明,肺动脉平滑肌细胞与血管重塑相关。细胞凋亡的内源性途径均由线粒体介导,也称凋亡途径是线粒体路径。有研究指出〔18〕,ALI大鼠肺组织细胞线粒体膜电位异常改变。Bax作为的促凋亡程序的主要参与者,可通过竞争性抑制抗凋亡蛋白活性,从而破坏线粒体路径〔19〕,基质长期处于高渗透状态下会导致线粒体膜损伤进而破裂,此阶段细胞质中会有大量的促凋亡蛋白,而Caspase蛋白酶家族会其发生酶解级联反应,而随着Caspase蛋白酶的激活会导致DNA受损,进而导致细胞凋亡。而作为抗凋亡蛋白的Bcl-2能够与线粒体膜上的结合蛋白发生联级反应,避免细胞膜受损。相关研究显示,释放调控Bcl-2/Bax信号,能够限制细胞凋亡,缓解ALI大鼠模型的血管重塑〔20〕。本研究结果说明,调控线粒体途径的相关蛋白表达水平可受盐酸氨溴索调控,从而降低肺动脉平滑肌细胞凋亡,进而改善肺血管重塑状态,发挥对ALI大鼠肺部的保护作用。

综上,肺平滑肌细胞可通过盐酸氨溴索降低凋亡率并对其血管重塑有改善作用,进而减少ALI肺组织损伤。但盐酸氨溴索在临床的实际应用效果,仍需深入研究。