汉族人群LRRK2基因突变携带者与非携带者患家族性帕金森病的风险预测

赵丽丽 张硕 张洋 王鹏 姜立刚

(1吉林医药学院附属医院,吉林 吉林 132000;2北华大学基础医学院)

家族性帕金森病(PD)通常与遗传基因存在一定的相关性,因此表现出一定的家族聚集性和区域性。目前研究已经发现有多种基因与该疾病的发生发展相关,如MAPT基因〔1〕、SNCA基因〔2〕及LRRK2基因〔3,4〕等,其中,LRRK2基因突变与PD的易感性的相关性已经成为目前研究的热点。随着研究的深入,LRRK2基因越来越多的突变位点被发现,同时也发现LRRK2基因突变位点种类具有很强的地域差异性,如p.G2385R、p.A419V等突变位点在亚洲人种族中被发现〔5〕,而p.M1646T仅在高加索人中发现〔6〕;不仅如此,在不同人种中LRRK2基因突变位点频率也有所区别,如p.R1398H突变位点在高加索人种中占约7%,而在亚洲人种族中占10%〔7〕。因此,虽然目前针对LRRK2基因突变对家族性PD易感性的关系已经有了部分研究〔8～10〕,但是对于汉族人种、尤其是吉林白山地区汉族人种的LRRK2基因突变类型及对家族性PD易感性的关系还有待进一步的研究。

本研究通过基因测序并运用统计学手段研究汉族家族性PD患者的LRRK2基因突变类型及在家族性PD患者中的分布频率,并与汉族非PD患者分布频率进行比较,以确定在吉林省白山地区LRRK2基因突变类型分布频率,并重点探讨LRRK2基因G2385R突变与家族性PD易感性的相关性。

1 材料与方法

1.1实验材料 Taq DNA聚合酶、dNTP及血液提取试剂盒购自大连TaKaRa公司;LRRK2基因目标扩增序列来源于NCBI网站,基因扩增引物由上海英俊公司订购,Sanger测序由上海华大基因测序公司完成;聚合酶链反应(PCR)扩增仪器购自杭州朗基科技股份有限公司;凝胶成像仪器购自上海天能科技股份有限公司。

1.2研究对象 于2017年1月至2022年12月在吉林省白山市、抚松县收集,并经吉林医药学院附属医院及北华大学附属医院确诊的58例汉族家族性PD患者为试验组,并随机选择了58例汉族的非PD患者的健康体检者为对照组。试验组中男31例,平均年龄(66.1±10.7)岁,平均患病时间为(7.2±5.1)年;女27例,平均年龄为(69.1±12.9)岁,患病时间为(8.4±6.5)年。对照组男31例,平均年龄(68.35±8.64)岁;女27例,平均年龄(68.76±10.48)岁。两组年龄及性别无统计学差异(P>0.05)。试验组入选标准是必须符合PD临床症状包含静止性震颤、动作迟缓及肌肉僵直3项指标中的两项以上,而对照组入选标准为不符合PD临床症状包含静止性震颤、动作迟缓及肌肉僵直3项指标中2项以上的健康体检者,同时采用磁共振成像(MRI)进行诊断明确分组。参与研究的对象均经本人同意并经伦理委员会批准。

1.3样本提取 抽取试验组和对照组研究对象的静脉血5 ml,存于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,取0.2 ml用于全血基因组DNA提取,剩余血液存放于-70 ℃冰箱。全血基因组DNA提取步骤参照血液提取试剂盒(TaKaRa公司)说明书,提取后的基因组DNA存放于-30 ℃冰箱以备实验使用。

1.4基因型检测 研究〔5〕发现,在吉林白山地区的LRRK2基因突变类型主要有p.G2019S、p.K616R、p.R1441C及p.G2385R 4类。本研究针对该4种突变位点设计引物,将样本基因组DNA进行扩增,取经验证的产物进行Sanger测序采用Primer5.0设计引物,分别扩增的G2019S(上游引物：5′-TGCTGCCATCATTGCAAAGATTG-3′,下游：5′-TCCCCATTCTACAGCAGTACTGA-3′)、K616R(上游引物：5′-CTTCCTTCCCACCAACAGG-3′,下游：5′-TGTCCATCAAAGTCACAGAGAG-3′)、R1441C(上游引物：5′-AGCAGGCCCAGTTTGAAAG-3′,下游：5′-G ACATTTCTAGGCAGTTGAGAATC-3′)和G2385R(上游引物：5′-GCACAGAATTTTTGATGCTTG-3′,下游：5′-GAGGTCAGTGGTTATCCATCC-3′)4个突变位点。50 μl反应体系对以上4个突变位点进行扩增,反应体系包含1×缓冲液、1 μmol/L上游引物/下游引物、1 U Taq DNA聚合酶、0.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP),最后加入1 μl全血提取的基因组DNA,最后放入PCR仪器中进行扩增,扩增程序为：95 ℃ 4 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min。程序结束后取3 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(2%)分析,验证合格后送经上海华大基因进行Sanger测序,以对LRRK2基因上的4个突变位点进行检测。

1.5磁共振成像(MRI)分析 采用Trio 1.5 T MRI系统(Siemens,Erlangen,Germany)进行MRI分析,患者在整个扫描过程中被要求安静、闭眼、情绪放松且大脑放空状态,图像采用平面回波成像(EPI)收集。层厚3 mm,矩阵256×256,视场24×24;EPI顺序为回波时间(TE)2.98 ms,重复时间(TR)2 300 ms,反转时间(TI)450.0 ms,反转角度9 °,平均次数(NEX)1,厚 1 mm。

1.6统计学分析 Sanger测序结果采用Chromas2.4软件分析并统计基因突变型的基因分布,采用SPSS20.0软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1测序结果及LRRK2基因突变型分布频率 p.G2385R基因突变型在汉族人群中所占的比例较大,且试验组LRRK2基因突变位点p.G2385R显著高于对照组(χ2=4.209,P<0.05),其他3组无显著性差异(均P>0.05)。见表1。

表1 LRRK2基因的基因突变型频率分布〔n(%),n=58〕

2.2MRI结果 试验组小脑、脑干未见萎缩,桥前池无增宽第四脑室未见扩张。均可除外PD综合征;双侧基底节、放射冠、脑干及小脑未见异常信号均可除外多发性脑梗死,更利于排除PD综合征的诊断。见图1。

图1 1例试验组患者全脑轴向切片MRI

3 讨 论

LRRK2蛋白是一种由2 527个氨基酸残基构成的多功能域的蛋白,目前发现的多中突变形式,而这些突变位点多与疾病的发生发展存在某种联系,如神经退行性疾病PD就与该基因的某些突变存在相关性,已经有研究证明,LRRK2基因某些多态性突变位点与发散性PD发病风险的相关性〔11〕。LRRK2基因某些多态性突变位点在PD发病过程中起着决定性作用,因此可以作为PD的易感基因。

研究〔5〕发现,在吉林白山地区的LRRK2基因突变类型主要有p.G2019S、p.K616R、p.R1441C及p.G2385R 4类。本研究中针对该4种突变位点设计引物,将样本基因组DNA进行扩增,取经验证的产物进行Sanger测序,结果显示家族性PD患者中p.G2385R突变型高出非PD患者2.21倍,提示通过人LRRK2基因p.G2385R突变位点的检测可能能够预测该携带者患有家族性PD的风险,进而给予早期关注和可能的干预。p.G2385R突变位点位于WD40功能区域,该功能域能够参与LRRK2蛋白的二聚体化,因此在区域发生突变后由于能够影响LRRK2蛋白的二聚体化而降低该蛋白激酶功能域的活性〔12〕。但是由于LRRK2蛋白参与细胞内的生命活动是一个十分复杂的生物信号转化作用,虽然p.G2385R位点发生突变后,WD40功能区域如何发生构象变化及LRRK2蛋白如何导致神经细胞功能的异常还有待深层次的研究,但是p.G2385R突变位点能够作为一种易感基因标志物来评价携带者患家族性PD的风险,也为临床家族性PD诊断和治疗提供一种新的方式。