椎间盘丸治疗腰椎间盘退变的网络药理学和生物信息学研究

陈璐璐,李 洋,吕文娟,张 迪

(河南省洛阳正骨医院 河南省骨科医院脊柱外三科,郑州 450000)

下腰痛(low back pain, LBP)是脊柱外科最常见的疾病之一,在成年人群中,LBP的发病率为10%～30%,65%～80%的人在一生中曾受到LBP的困扰[1]。LBP严重影响患者的生活质量,降低患者的劳动能力,给家庭和社会造成巨大的负担。引起LBP的原因有很多,其中腰椎间盘退变是最常见原因之一[2]。大部分腰椎间盘源性LBP经6～12周的保守治疗可以取得满意的效果[3-4]。椎间盘源性LBP的保守治疗方法包括卧床休息[5]、药物治疗[6]、运动疗法[7]、硬膜外注射[8]、腰椎牵引[9]、手法治疗[10]等。但是经保守治疗后临床症状的复发率仍高达25%[3]。此外,治疗椎间盘源性LBP的药物多为对症治疗,且长时间使用均存在或多或少的不良反应。中药在临床上被广泛应用于腰椎间盘退变性疾病地治疗,并取得了不错的临床效果[11-12]。椎间盘丸(zhuijianpan pill,ZJPW)是河南省洛阳正骨医院治疗腰椎间盘退变的协定处方,该方由当归、桂枝、细辛、黄芪、白芍、延胡索、威灵仙、五加皮、牛膝、甘草等药物组成,具有温通经脉、养血散寒、理气止痛之功效。ZJPW在临床应用中取得了良好的疗效,但是其抑制腰椎间盘退变的分子机制尚未完全阐明。

网络药理学是近年来发展起来的新兴学科,其以系统生物学为基础,整合了系统生物学、多向药理学、生物信息学和计算机科学,为寻找药物分子和疾病的相互关系提供了新的手段[13]。中医理论注重整体观念,而单一的药物成分研究不能充分揭示中药的作用机制,因此运用网络药理学技术挖掘复方中药治疗疾病的分子机制逐渐受到广大临床医生的关注。本研究运用网络药理学的方法筛选ZJPW治疗腰椎间盘退变的主要成分和作用靶点,并利用分子对接技术进行验证。最后使用CIBERSORT工具计算免疫细胞与致病基因的相关性,从免疫浸润角度探讨药物作用的分子机制。为ZJPW用于腰椎间盘退变的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 ZJPW有效活性成分的确定 按照既往文献的方法[14],使用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)筛选ZJPW组方中10味中药当归、桂枝、细辛、黄芪、白芍、延胡索、威灵仙、五加皮、牛膝、甘草的有效成分。以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%,类药性(drug-likeness,DL)>0.18为标准筛选出该组方中可能有效的化学成分。在TCMSP数据库和drugbank数据库(https://go.drugbank.com/)中检索这些活性成分对应的蛋白质靶点。最后利用蛋白质数据库UniProt(https://www.uniprot.org/)将蛋白靶点转换成对应的基因名称,得到ZJPW中各药物成分的靶点基因。

1.2 获取腰椎间盘退变的相关基因 在GeneCards数据库(https://www.Genecards.org)、靶向治疗数据库(therapeutic target Database,TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)和药物基因组学知识库(pharmacogenomics knowledgebase,PharmGKB)(https://www.pharmgkb.org/)中检索腰椎间盘退变的致病基因,合并并删除重复基因。以nucleus pulposus[All Fields] AND “Homo sapiens”[porgn] AND “Expression profiling by array”[Filter]为检索式在GEO数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)进行检索,选择GSE15227作为研究对象,提取椎间盘Ⅱ级退变样本5个,Ⅳ级退变样本3个,以P<0.05和log|FC|>1为标准筛选差异表达基因。将筛选出的差异表达基因与之前获得的致病基因取交集,得到腰椎间盘退变的致病基因。再将药物靶点基因和致病基因取交集,最终得到ZJPW有效成分的作用靶点。

1.3 构建“药物-成分-作用靶点”关系网络 将药物、活性成分和作用靶点之间的关系导入Cytoscape 3.9.1 软件,构建“药物-成分-作用靶点”网络,用“节点”表示药物、活性成分和作用靶点,用“边”表示节点之间的相互作用,节点大小和边的粗细表示度值的大小。

1.4 基因本体论(gene ontology,GO)功能和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopediaof genesand genome,KEGG)富集分析 使用R 软件的“clusterProfiler”包和“pathview”包对ZJPW治疗腰椎退变的靶点基因进行GO和KEGG富集分析。其中GO分析包括生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC) 和分子功能(molecular function,MF)3部分。以FDR<0.05作为GO和KEGG富集分析的筛选条件,取排名靠前的10个条目分别绘制气泡图。对GSE15227的全部基因进行差异分析后,以“c2.cp.v7.2.symbols.gmt”为参考基因集,以FDR<0.25且p.adjust<0.05为条件进行GSEA富集分析。

1.5 构建蛋白质- 蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络 在STRING 数据库中,以置信度分数(Score)> 0.9 为筛选条件,构建PPI网络。将得到的tsv文件导入Cytoscape3.9.1 软件,分别使用CytoNCA插件(以度值进行排序,取度值>10的基因)和MCODE插件(以节点评分cut-off值=0.2、K-Core值=2、度值cut-off =2为默认参数进行聚类关联分析,取得分最高的聚类)筛选ZJPW治疗腰椎间盘退变的关键基因。将两种方法筛选得到的关键基因取交集,最终得到的交集基因被认为是ZJPW治疗腰椎间盘退变的Hub基因。

1.6 分子对接验证 选取“药物-成分-作用靶点”网络中连接度值排名前10 位的活性成分分别与Hub基因进行分子对接验证。在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载前10位活性成分的2D 结构并进行3D转换。在PDB 数据库(https://www.rcsb.org/)下载Hub基因对应蛋白的3D 结构,利用Pymol 软件和AutodockTools-1.5.6软件处理后保存为pdbqt 格式。在AutodockTools-1.5.6 软件中设置蛋白受体的口袋参数,通过AutodockVina进行分子对接,在分子对接过程中结合能越低代表受体与配体的亲和力越好。将分子对接的结合能进行评分并绘制热图。

1.7 免疫浸润分析 将从GEO数据库获得的基因表达谱数据上传到CIBERSORT网站,得到免疫细胞浸润矩阵。使用“ggplot2”包绘制Ⅱ级退变组和Ⅳ级退变组免疫细胞浸润差异的小提琴图。再以Hub基因的表达中位数将全部样本分为Hub基因高表达组和Hub基因低表达组,同样的方法绘制Hub基因高低表达组免疫细胞浸润差异的小提琴图。最后分析Hub基因和免疫细胞浸润的相关性,并使用“ggpubr”包绘制棒棒糖图。

2 结果

2.1 ZJPW活性成分及靶基因 共筛选得到“白芍”活性成分13个、“五加皮”活性成分16个、“当归”活性成分2个、“甘草”活性成分92个、“桂枝”活性成分7个、“黄芪”活性成分19个、“牛膝”活性成分20个、“威灵仙”活性成分7个、“细辛”活性成分8个、“延胡索”活性成分49个(见表1)。在TCMSP数据库和drugbank数据库中得到“白芍”作用靶点990个、“五加皮”作用靶点17个、“当归”作用靶点864个、“甘草”作用靶点2 507个、“桂枝”作用靶点2 402个、“黄芪”作用靶点953个、“牛膝”作用靶点1 034个、“威灵仙”作用靶点310个、“细辛”作用靶点1 668个、“延胡索”作用靶点1 549个。利用UniProt数据库将靶点转换成对应的基因名称,去除重复基因后,共得到ZJPW活性成分的靶基因共1 283个。

表1 ZJPW的药物组成及活性成分

2.2 ZJPW治疗腰椎间盘退变的潜在作用靶点 在GeneCards、OMIM和PharmGKB数据库中检索得到腰椎间盘退变的靶点基因2 458个。在GSE15227数据集中得到腰椎间盘Ⅱ度退变和Ⅳ度退变样本的差异表达基因1 104个,选取表达谱中表达上调和下调排名前20基因绘制热图(见图1A)。将上述基因取交集,共得到271个腰椎间盘退变相关的疾病靶点基因(见图1B)。再将ZJPW活性成分的靶基因与腰椎间盘退变的致病基因取交集,共得到23个基因,这23个基因即为ZJPW治疗腰椎间盘退变的潜在作用靶点(见图1C)。

注：A:GSE15227数据集中椎间盘Ⅱ度退变和Ⅳ度退变样本的差异表达基因;B:GeneCards、OMIM 和PharmGKB数据库中的致病基因与GSE15227数据集中的差异基因取交集;C:药物作用靶点与致病基因取交集;D:“药物-活性成分-作用靶点”网络图。

2.3 “药物-活性成分-作用靶点”网络的构建 将药物、活性成分和作用靶点数据导入Cytoscape 3.9.1软件,绘制“药物-活性成分-作用靶点”网络图,共得到170个节点,384条边(图1D)。根据连接度值大小排序,排在前10位的化合物是槲皮素、汉黄芩素、β-谷甾醇、黄芩黄素、山柰酚、甘草查尔酮A、芝麻素、尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇和隐品碱。这些成分主要来源于牛膝、细辛、白芍等药物。见表2。

表2 排名前10位的活性成分及来源药物

2.4 GO、KEGG和GSEA富集分析 对腰椎间盘退变的23个潜在治疗靶点基因进行GO和KEGG富集分析,筛选条件为FDR<0.05。在BP方面,靶点基因主要富集在泌乳(lactation)、蛋白质磷酸化的调节(regulation of protein phosphorylation)、对外来生物刺激的反应(response to xenobiotic stimulus)和血管生成(angiogenesis);在CC方面,靶点基因主要富集在细胞外空间(extracellular space)、细胞外基质(extracellular matrix)、内质网腔(endoplasmic reticulum lumen)和细胞外区域(extracellular region);在MF方面,靶点基因主要富集在酶结合(enzyme binding)、相同的蛋白结合(identical protein binding)、蛋白结合(protein binding)和蛋白酶结合(protease binding)(见图2A)。从KEGG 通路富集分析中可以看出,这些基因主要富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications),蛋白聚糖在癌症(proteoglycans in cancer),PI3K-Akt 信号通路以及人乳头瘤病毒感染(见图2B)。GSEA富集分析共得到83个符合条件的数据集,这些基因主要富集在固有免疫、VEGFR2信号通路、感染性疾病、选择性自噬和胶原蛋白相关信号通路(见图2C)。

注：A:药物靶点基因的GO分析;B:药物作用靶点的KEGG分析;C:GSE15227数据集中差异表达基因的GSEA分析。

2.5 PPI网络构建 在STRING数据库中获得药物靶点基因的PPI网络,将得到的结果导入Cytoscape 3.9.1软件进行可视化和聚类筛选(见图3A)。利用Cytoscape中的“Network analyzer”工具计算无方向PPI网络中每个节点的评分,得到每个节点的度值。用节点的大小表示度值,用边的宽度表示这条边的综合得分值,筛选出度值≥15的节点,共24个节点,166条边(见图3B)。随后分别使用MCODE插件和CytoNCA分别筛选Hub基因,在MCODE插件中得分最高的是聚类包含9个节点(见图3C)。在CytoNCA分析中,度值>10的基因共有5个(见图3D)。将使用MCODE插件分析得到的结果和使用CytoNCA插件分析得到的结果取交集,共得到PTGS2、HIF1A、VEGFA、FN1和CAV1共5个Hub基因。这5个Hub基因可能是ZJPW治疗腰椎间盘退变的关键位点。

注：A:药物靶点基因的PPI网络;B:按度值≥15筛选并排序;C:CytoNCA法筛选出的Hub基因;D:MCODE法筛选出的Hub基因。

2.6 分子对接验证 取度值排名前10位的活性成分分别与筛选出的5个Hub基因进行分子对接。在分子对接过程中,受体和配体的结合能越小表明结合活性越好。结果显示,与PTGS2结合能最小的活性成分是槲皮素、汉黄芩素和山柰酚;与HIF1A结合能最小的活性成分是槲皮素、山柰酚和甘草查尔酮A;与VEGFA、CAV1和FN1结合能最小的活性成分均为槲皮素、山柰酚和黄芩黄素。见表3、图4。

注：A-C:CAV1分别与槲皮素、黄芩黄素和山柰酚对接;D-F:FN1分别与槲皮素、黄芩黄素和山柰酚对接;G-I:HIF1A分别与槲皮素、山柰酚和甘草查尔酮A对接;K-M:PTGS2分别与槲皮素、山柰酚和汉黄芩素;N-P:VEGFA分别与槲皮素、黄芩黄素和山柰酚对接。

表3 排名前10位的活性成分与靶点基因对接结合能

2.7 免疫浸润分析 CIBERSORT免疫浸润分析显示,一共有22种免疫细胞在受测样本中表达,从免疫细胞浸润差异的小提琴图可以看出,Ⅱ级退变组和Ⅳ级退变组免疫细胞浸润无明显差异(见图5A)。按照HIF1A的高低表达分组后我们发现,在HIF1A高表达组中,激活的NK细胞显著升高(见图5B)。免疫细胞与HIF1A的相关性分析也发现,激活的NK细胞与HIF1A呈显著的正相关(见图5C)。

注：A:椎间盘Ⅱ级退变和Ⅳ级退变免疫细胞浸润的差异,红色表示Ⅱ级退变,蓝色表示Ⅳ级退变;B:HIF1A高低表达组免疫细胞浸润的差异,红色表示HIF1A高表达,蓝色表示HIF1A低表达;C:HIF1A和免疫细胞的相关性分析。

3 讨论

腰椎间盘退变是引起LBP最常见的原因之一[15]。中药是治疗腰椎间盘退变的重要手段[11, 16]。中药多取材于天然动植物,其不良反应较小,且可以在多个靶点起作用,从而达到整体施治的目的[17-19]。ZJPW虽然已经被广泛应用于临床,并取得了令人满意的临床效果,但是其治疗腰椎间盘退变的分子机制尚未完全阐明。

在本研究中,笔者通过数据库分析,共得到ZJPW的有效活性成分139个,其中最重要的成分是槲皮素、汉黄芩素、β-谷甾醇、黄芩黄素、山柰酚、甘草查尔酮A、芝麻素、尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇和隐品碱。这些活性成分主要来源于牛膝、细辛、白芍等药物。槲皮素是一种重要的抗衰老药物,可以通过SIRT1信号通路调节细胞自噬或通过Nrf2/NF-κB信号轴抑制衰老相关的分泌表型(senescence associated secreted phenotype,SASP)因子的表达,从而减缓腰椎间盘退变[20-21]。有研究[22]还发现,抗衰老药物达沙替尼和槲皮素长期联合使用可显著改善小鼠年龄相关的椎间盘退变。黄芩黄素是黄芩中含量最高的黄酮类化合物之一,具有抗肿瘤和抗炎等多种作用,在多种肿瘤和炎症性疾病的治疗中起重要作用[23-25]。在体外实验中,黄芩黄素可抑制髓核细胞中由IL-1β诱导的炎症反应,从而延缓椎间盘的退变[26]。山奈酚也是一种黄酮类化合物,自然存在于茶以及许多常见的蔬菜和水果中,具有抗氧化、抗骨质疏松、抗炎等多种功能,被广泛用于治疗许多急性和慢性炎症引起的疾病,包括椎间盘退行性变和结肠炎以及绝经后骨质流失和急性肺损伤[27]。 体外实验发现,山奈酚可通过改善LPS诱导的BMSCs成骨/成脂失衡和炎症反应来减缓椎间盘退变[28]。汉黄芩素可通过介导细胞信号通路和免疫应答发挥抗癌、抗炎、治疗细菌和病毒感染等多种生物学活性[29-31]。体外实验也发现,汉黄芩素可通过Nrf2/ARE和MAPK信号通路减轻椎间盘退变[32]。以上研究结果与本研究筛选出的ZJPW活性成分是一致的,这说明ZJPW可能是通过上述活性成分发挥治疗椎间盘退变的作用。本研究结果发现,ZJPW的靶点基因主要富集在PI3K-Akt信号通路,有研究[24]也表明,黄芩黄素可以通过PI3K/Akt/NF-κB通路提高A549肺腺癌细胞对顺铂的敏感性。因此笔者推测,ZJPW也可能通过PI3K/Akt信号通路调节椎间盘细胞的活性,从而延缓椎间盘退变的发生。活性成分与信号通路的具体调控机制将在接下来的实验研究中进一步阐明。

本研究通过PPI网络筛选出了ZJPW的主要作用靶点是PTGS2、HIF1A、VEGFA、FN1和CAV1。PTGS2是环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,Cox-2)的编码基因,有研究[33-34]表明,COX-2在退变的髓核细胞中是表达上调的,而阿司匹林可以抑制COX-2的表达,从而延缓椎间盘退变的发生。本研究通过分子对接技术发现,与PTGS2结合能最小的ZJPW活性成分是槲皮素、汉黄芩素和山柰酚。有研究[35-37]表明,这些成分都具有下调COX-2的表达的作用。如前所述,COX-2的高表达是引起椎间盘退变的重要因素之一。因此笔者推测,下调髓核细胞中COX-2的表达可能也是ZJPW治疗腰椎间盘退变的分子机制之一。

HIF1A可激活多种基因的转录,是细胞和全身对缺氧的稳态反应的主要调节因子,参与能量代谢、血管生成、细胞凋亡相关基因的调控。在椎间盘退变过程中HIF1A是否起正面作用目前尚有争议,但可以肯定的是HIF1A是准确诊断和治疗椎间盘退变不可缺少的参考指标[38]。有研究[39-41]发现,HIF1A通过上调自噬缓解压应力诱导的髓核来源干细胞凋亡[42]。本研究结果发现,在分子对接过程中槲皮素、山柰酚和甘草查尔酮A与HIF1A的结合能最小。而实验研究证实[39, 43],这些化合物均对HIF1A具有抑制作用。因此笔者认为,HIF1A是椎间盘退变的危险因素,而ZJPW可以通过下调HIF1A的表达发挥治疗椎间盘退变的作用。值得一提的是,有研究[44]认为,外周血中NK细胞数量增多可能加速腰椎间盘退变。也有研究[45]认为,腰椎间盘突出患者的外周血NK细胞较正常对照组减少。而本研究结果发现,HIF1A与活性NK细胞呈显著的负相关。故笔者认为,ZJPW可以下调HIF1A,进而减少活性NK细胞的数量,从未抑制椎间盘退变。

VEGFA是血管内皮生长因子家族的一员,它可促进新生血管形成和使血管通透性增加。椎间盘是一个乏血供组织,其内的髓核细胞靠软骨终板的渗透作用提供营养物质和带走代谢产物。因此,紧贴软骨终板的椎体骨性终板的血供对椎间盘的退变起着至关重要的作用。血管内皮细胞凋亡可导致终板微血管密度降低,进而导致椎间盘退变[46]。在持续压迫导致的椎间盘退变过程中,VEGFA起重要作用[47]。本研究结果发现,与VEGFA结合的ZJPW活性成分主要是槲皮素、山柰酚和黄芩黄素。这些化合物可以上调VEGFA的表达,促进血管生成,但是有趣的是,在某些肿瘤中这些化合物下调VEGFA的表达,从而起到抑制肿瘤生长的作用[48-50]。因此笔者认为,ZJPW可能通过增加骨性终板VEGFA的表达促进血管生成,或通过减少软骨终板的血管化而达到治疗椎间盘退变的作用。

综上所述,本研究通过数据库挖掘确定了ZJPW的有效活性成分,进一步使用网络药理学技术筛选出该药物治疗腰椎间盘退变的关键靶点,并初步探讨了药物作用的分子机制,最后利用分子对接技术对实验结果进行了初步验证,为ZJPW的深入研究、开发和应用提供了参考。