补肾壮阳类中成药中15 种非法添加化学药物的检测方法研究

朱泽兵 郭娅 张德伟 张华

（1.重庆市万州食品药品检验所 重庆万州 404000；2.三峡库区道地药材开发利用重庆市重点实验室）

0 引言

补肾壮阳类中成药具有调理机体、益精填髓、补益肾气、促进气血运行的作用，备受消费者青睐，但市售补肾壮阳类中成药鱼龙混杂，部分不法商家为提高疗效谋取利益，在制售这类中成药时非法添加许多化学物质。这些非法添加物对人体有害，部分物质有促使血管平滑肌扩张的作用，会增加外周副交感神经的张力，长期服用会导致服用者出现头昏、头痛、恶心、腹泻、心悸、排尿困难、面部潮红等不良反应[1-3]。

目前，我国检测补肾壮阳类中成药中非法添加物的方法主要包括理化分析检测技术、薄层色谱检测技术、高相液相色谱技术等[4]，虽然这些方法操作简便，但是样品中的其他成分会对检测造成较大干扰。此外，补肾壮阳类药品成分复杂，因此还需要与其他检测技术一起结合使用。其中较为高效的检测技术有液相色谱-质谱技术[5-6]，X 射线衍射法检测技术等[7-9]。除此之外，用于中成药中化学成分的检测技术还包括近红外光谱技术、拉曼光谱技术[10-13]等。本实验旨在探究一种检测补肾壮阳类中成药中非法添加育亨宾等15 种化学药的检测方法，构建一种快速定性和定量检测的方法，为这类非法添加药物的监测提供技术支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器

QExactive Focus 型高分辨液质联用仪（赛默飞世尔科技有限公司）；梅特勒XP204 型万分之一电子天平（梅特勒托利多公司）；ME215S 型十万分之一天平（梅特勒托利多公司）；KQ-800DE 型超声波提取器（昆山市舒美超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与对照品

乙腈（分析纯），乙腈（色谱纯，KNOWLES），超纯水；他达那非（22020284，100.0%）、氨基他达那非（520042-201401，99.8%）、那红地那非（520039-201902，99.5%）、伪伐地那非（520041-201401，99.8%）、那莫西地那非（520040-201401，99.5%）、红地那非（520047-201401，99.9%）、西地那非（51068-201401，99.9%）、豪莫西地那非（520046-201401，99.6%）、伐地那非（21120456，100.0%）、硫代艾地那非（520048-201401，99.5%）、羟基豪莫西地那非（23462，99.9%）、去甲基他达那非（171596，99.8%）、育亨宾（520024-201401，99.0%）、硫代西地那非（26014，99.8%）、前列地尔（140659-201805，99.0%）。

他达那非、伐地那非购自斯坦福生物科技有限公司，羟基豪莫西地那非、去甲基他达那非、硫代西地那非购自曼哈格生物科技有限公司，其余对照品购自中国食品药品检定研究院。

1.3 检测样品信息

金刚片（210301）、健身全鹿丸（200801）、肾宝（2003073）、壮肾丸（2109011）、参茸鞭丸（190409）、五子衍宗丸（2007009）、参茸鞭丸（10520021）、养血荣筋丸（200255）、芪香益肾颗粒（20061）、男宝胶囊（201906）、八味益肾丸（870115）、金水宝胶囊（191219）、舒筋健腰丸（L23051）、肾康宁颗粒（20200505）、阿胶益寿口服液（200924）、参鹿健肺胶囊（200501）、冬青补汁（190603）、鹿茸口服液（20190601）、益气养血口服液（191024）、六味地黄丸（1802001）、八子补肾胶囊（A1805001）、参芝安神口服液（190402）、人参北芪胶囊（2006003）、蚁黄口服液（190903）、五加茸口服液（210108）、鹿茸口服液（201208）、参茸养心益肾胶囊（20210602）、健脑补肾口服液（20091202）、参茸补肾片（201141057）、三肾丸（200725）、三肾丸（岢岚方）（20201102）、八味益肾胶囊（870211）、虫草双参酒（201502）。

以上样品部分在药店购得，部分由公安部门提供。

2 实验方法

2.1 UPLC 检测条件

waters BEH@C18色谱柱（1.7×100 mm，1.7 μm）；流动相A 为乙腈溶液，流动相B 为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱（0～10 min：10%～65%A，14.1～15 min：10%～95%A）；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；柱温：40℃。

2.2 MS 检测条件

离子源采用ESI 源，喷雾电压：3 kV；电离的模式：正向（负向）离子扫描；检测方法：一级全扫描（Full-MS）；扫描范围：300～600 m/z；二级选择离子扫描；一级分辨率：70 000，二级15 000；鞘气流速：35 L/min；辅助气流速：10 L/min；毛细管温度：320℃。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品溶液制备

精确称量“1.2”中所列的对照品各5 mg 于25 mL量瓶中，加入甲醇使其充分溶解，即得对照品混合储备溶液。精确吸取1 mL 置于100 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度并摇匀，即得浓度为1 000 ng/mL 对照品混合溶液。

2.3.2 样品溶液的制备

将“1.3”中所列的样品进行预处理，将片剂、丸剂、颗粒剂各取2 份研磨成粉末，胶囊剂取里面的内容物研磨成粉末；精确称量每个样品1 g（液体样品取1 mL）置于50 mL 量瓶中，加入25 mL 乙腈，超声萃取30 min；然后将其取出并冷却至室温，取上清液用0.22 μm 的微孔滤膜滤过，即得样品溶液。

2.4 各化合物标准谱库信息

精密量取“2.3”项下的混合对照品溶液2 μL，按“2.1”和“2.2”项下条件进样分析，记录质谱图，得到各化合物母离子及总离子流图，并对各母离子进行二级扫描得到主要子离子，具体详见表1、图1 和图2。

图1 各成分总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of each component

图2 各成分二级质谱图Fig.2 secondary mass spectrum of each component

表1 15 种非法添加物的保留时间和质谱参数Table 1 15 retention time and mass spectrum parameters of illegal additives

2.5 灵敏度分析

将“2.3.1”项下的对照品混合溶液无限稀释，在“2.1”、“2.2” 项下的色谱-质谱条件下测定15 种非法添加物的S/N（信噪比），用3 倍信噪比的方式计算得到检测下限，用10 倍信噪比的方式计算得到定量下限。所得结果详见表2。

表2 15 种添加物的检测下限和定量下限Table 2 15 lower limits of detection and quantification of additives

2.6 线性关系的考察

按照“2.3.1”项下的顺序依次取5、10、20、40、80、200 ng/mL 的对照品混合溶液，并在“2.1”、“2.2”的色谱条件下进行检测，检测结果以质量浓度为X 轴，峰面积为Y 轴，制作标准曲线图，得到15 种目标化合物的回归方程、线性范围和相关系数，详见表3。

表3 15 种非法添加物的回归方程、线性范围和相关系数Table 3 15 regression equation，linear range and correlation coefficient of illegal additives

2.7 回收率试验

取空白样品6 份，精密称取空白样品各1 g（液体空白样品各1 mL），置于50 mL 量瓶中，加入25 mL乙腈，超声波处理30 min，冷却至室温。取上清液用0.22 μm 微孔滤膜滤过，精密加入上述对照品混合溶液0.25mL，即得。计算求得加样回收率，详见表4。

表4 15 种添加物的平均回收率、精密度及标准差（n=6）Table 4 15 the average recovery，precision and standard deviation of additives（n=6）

2.8 样品测定

将所收集的样品按“2.3.2”项下处理方式进行处理，上机检测。在检测的34 批样品中，检测发现有6批样品中添加了化学药物，如西地那非、他达那非、育亨宾，其中育亨宾添加的次数最多且检测到的浓度最高，其余样品中检测到含有多种非法添加物，但其浓度较低，结果详见表5。

表5 样品检测结果（ng/mL）Table 5 Results of sample testing（ng/mL）

3 讨论与结论

将这15 种目标添加物分别在正、负离子的模式下考察其质谱响应强度。结果表明，这15 种目标化合物具有较高的[M+H]+峰响应强度稳定性，故在本次实验中选择用正离子模式扫描。由于在实际的实验中前列地尔在正离子模式下的反应不强烈，而在负离子模式下反应强烈，所以我们采用了负离子模式扫描来检测前列地尔。最后通过调整母离子的碰撞的方式来优化子离子，对每一化合物进行选择性筛选，得到具有高稳定性、高响应的离子。

在检测的34 批样品中，发现育亨宾含量极高且添加次数较多，这是由于育亨宾并不在国家药品监督管理局批准的补充检验方法2009030 中所列的11 种违法添加化学物质的范围之内，故一些不良商家避开药品监督管理部门的检验，在补肾壮阳类中成药中添加育亨宾来增强药效。因此，有关部门应尽快完善补充检验方法，加大对这类产品的监督力度，为消费者的健康提供保障。此外，还发现一些商家向这类中成药中添加一些浓度很低的非法药物，一般的检测仪器不易检出，以此来弄虚作假。本方法可对补肾壮阳类中成药进行快速检验且检测限很低，这对于打击不良商家在中成药中添加化学药物的制假掺伪行为提供了一定的技术支持，有利于保障消费者的用药安全。