利用超临界CO2萃取川续断挥发油的试验研究

张玉，周孟焦，邹静，李潮俊，梁晓峰

1.西南科技大学材料与化学学院（绵阳 621010）；2.四川中医药高等专科学校绵阳市中药资源开发利用重点实验室（绵阳 621010）

续断是川续断科植物川续断（Dipsacus asperwall.Ex Henry）的干燥根，又名川断，《神农本草经》将其列为上品，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏、安胎等功效，资源丰富，应用久远[1]，也有记载将续断作为药膳。川续断化学成分主要有挥发油类、三萜皂苷类、生物碱类、环烯醚萜类，其中，挥发油为其主要成分之一[2]，有文献报道，精油具有较好的抑菌、抗氧化作用[3]。

川续断挥发油的提取方法主要包括水蒸气蒸馏、溶剂萃取和酶辅助提取[3]，在这几种方法中，水蒸气蒸馏法提取有时间长、耗能较大等问题，使得提取率低，甚至难以收集。溶剂萃取法存在工艺复杂、耗时长、提取效率低等问题。超临界CO2萃取是近几年发展起来的一种中药萃取方法，因其萃取速度快、流程短、效率高、能耗少，适合于热敏组分的萃取而受到学者广泛关注[4-6]。

由于川续断的主要药用部位在其根部，根部主要是木质结构，需要加入一定的携带剂以改变超临界CO2的溶解性，萃取其易挥发性成分。超临界CO2萃取法萃取川断中挥发油工艺研究少见报道。因此，在单因素试验基础上，采用正交设计试验优选出超临界CO2萃取法萃取川继断挥发油最佳工艺[7-8]，并探究其抗氧化性，以期为川续断更广泛的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

川续断（购自江西臻药堂药业股份有限公司），经四川省四川中医药高等专科学校王化东副教授鉴定为川续断科植物川续断（Dipsacus asperwall.Ex Henry）的干燥根，清洗、烘干、粉碎并过0.850 mm（20目）筛；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，国药集团化学试剂有限公司）；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS+，上海麦克林生化科技有限公司）；乙醇为分析纯；水为纯化水。

1.2 仪器与设备

HA120-50-01超临界CO2萃取装置（南通华安超临界萃取有限公司）；752N Plus紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；RE52CS-2旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；QP2020气质色谱-质谱仪（GC-MS，日本Shimadu公司）。

1.3 方法

1.3.1 超临界CO2装置萃取川续断挥发油

称取15 g（S0，所有川续断样品皆粉碎，过0.850 mm筛）川续断粉末，无水乙醇作为携带剂，经携带剂泵泵入，设定萃取条件，进行动态萃取，从分离釜收集萃取液。提取得到的川续断挥发油未旋蒸样品为橙色液体，散发特殊香味，溶剂去除后的样品为橙黑色黏稠液体，同样散发特殊香味。由于萃取液中的目标产物在光热条件下不稳定，因此，选择40 ℃旋干携带剂，旋干后所得萃取物即为最终产物（S1），称重并计算挥发油萃取率。

2 结果与分析

2.1 超临界CO2装置萃取川续断挥发油的工艺优化

2.1.1 单因素试验

采用超临界CO2萃取法提取川续断挥发油，以萃取时间、萃取温度、萃取压力、携带剂的浸泡时间和料液比（物料与携带剂比例）等作为考察因素，以川续断挥发油的萃取率为评价指标，考察各个因素对川续断萃取率的影响。

2.1.1.1 携带剂浸泡时间对川续断挥发油萃取率的影响

在物料与携带剂比例1∶2.5（g/mL）、萃取温度50 ℃、萃取时间1 h、萃取压力20 MPa、分离温度45℃的条件下，设置浸泡时间0，0.5，1.0，1.5和2.0 h这5个水平，计算挥发油萃取率，结果见图1。

图1 浸泡时间对萃取率的影响

结果表明：起初携带剂与原料未完全接触，萃取率较低；随着时间逐渐延长，浸泡面积增大，萃取率逐渐增大；1.0 h之后，萃取率下降，可能是在一定温度下，物料和携带剂在萃取釜中时间较长，部分乙醇挥发，使得萃取率逐渐下降。因此，选择浸泡时间0.5，1.0和1.5 h作为正交试验浸泡时间的水平。

2.1.1.2 料液比对川续断挥发油萃取率的影响

在浸泡时间1 h、萃取温度50 ℃、萃取时间1 h、萃取压力20 MPa、分离温度45 ℃的条件下，设置物料比1∶1.5，1∶2，1∶2.5，1∶3和1∶3.5（g/mL）5个水平，计算挥发油萃取率。结果见图2。

图2 料液比对萃取率的影响

结果表明：随着料液比比值的减小，萃取率呈现先上升后下降趋势。料液比1∶3（g/mL）的萃取率不升反降，原因可能是携带剂用量对超临界流体和溶质的接触面积造成一定的影响，料液比1∶3（g/mL）时，物料全部浸泡在携带剂中，使得超临界流体与物料无法充分接触，从而其萃取大幅降低。因此，选择料液比1∶2.5（g/mL）。

2.1.1.3 萃取时间对川续断挥发油萃取率的影响

在物料与携带剂比例1∶2.5（g/mL）、浸泡时间1 h、萃取温度50 ℃、萃取压力20 MPa、分离温度45℃的条件下，设置萃取时间0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，5个水平，计算挥发油萃取率，结果见图3。

图3 萃取时间对萃取率的影响

结果表明：在反应刚开始时，CO2与物料接触面积比较小，萃取率较低；随着萃取时间延长，超临界流体与物料接触面积增大，萃取率增大；1.5 h之后，萃取率增加缓慢，萃取效果提高不明显，可能是因为萃取时间延长，携带剂部分挥发，使得萃取率降低。因此萃取时间选择1.5，2.0和2.5 h作为正交试验萃取时间水平。

2.1.1.4 萃取压力对川续断挥发油萃取率的影响

在物料与携带剂比例1∶2.5（g/mL）、浸泡时间1 h、萃取温度50 ℃、萃取时间1 h、分离温度45 ℃的条件下，设置萃取压力16，18，20，22，24和26 MPa这5个水平，计算挥发油萃取率，结果见图4。

图4 萃取压力对萃取率的影响

结果表明，随着压力逐渐增大，萃取率逐渐上升，后逐渐得到平缓。这可能是因为反应刚开始，萃取压力的增加使得CO2的溶解性显著增强，从而提高萃取率。超过22 MPa时，萃取压力提高，萃取率几乎不变，从安全角度来看，选择20，22和24 MPa作为正交试验萃取压力的水平。

2.1.1.5 萃取温度对川续断挥发油萃取率的影响

在物料与携带剂比例1∶2.5（g/mL）、浸泡时间1 h、萃取时间1 h、萃取压力20 MPa、分离温度45 ℃的条件下，设置萃取时间35，40，45，50和55 ℃这5个水平，计算挥发油萃取率，结果见图5。

图5 萃取温度对萃取率的影响

结果表明，萃取刚开始，萃取率随着萃取温度的升高而呈现升高趋势，萃取温度45 ℃后，萃取率下降，可能是因为在超临界萃取过程中，萃取温度主要受到升温所增加的扩散系数与所降低的CO2密度2种效应的影响，温度适当升高有助于溶质扩散速度加快，萃取率得以提高，一旦温度升高到一定程度，超过这个限度，CO2对溶质的溶解能力降低，萃取率开始不升反降，同时温度过高会使得乙醇和产物挥发较快，热敏香味成分分解，对其品质产生负面影响，因此选择温度40，45和50 ℃作为正交试验的水平。

2.1.2 正交试验设计

在单因素试验基础上，选择浸泡时间（A）、萃取压力（B）、萃取温度（C）、萃取时间（D）为自变量，进行L9(34)正交试验，因素水平见表1，正交试验设计与结果见表2与表3。

表1 因素水平表

表2 L9(34)正交试验设计及结果

表3 方差分析结果

由表2中极差分析可知，川续断萃取率的各因素影响程度大小依次为A＞B＞C＞D。表3中方差分析表明，A、B、C对挥发油提取率有显著影响（P＜0.05），A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C1＞C3＞C2，D3＞D1＞D2，故A因素选择A2水平，B因素选择B3水平，C因素选择C1，D因素选择D3，因此川续断挥发油提取工艺最优设计方案是A2B3C1D3，即物料比1∶2.5（g/mL）、浸泡时间1 h、萃取压力24 MPa、萃取温度40 ℃、萃取时间2.5 h。

2.1.3 验证试验

验证试验见表4。

表4 验证试验表 单位：%

2.2 川续断挥发油的GC-MS分析

2.2.1 色谱条件

色谱柱为非极性SH-RXi-5Sil MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为氦气；进样温度290℃。柱箱温度（采用程序升温方案）：柱初始温度50℃，保持5 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至290 ℃，保持10 min；进样量1 μL；分流比10∶1；柱流量1.0 mL/min；溶剂延迟时间3 min。质谱条件：离子源为电子轰击离子源（EI）；离子源温度200 ℃；接口温度220 ℃；检测电压0.8 kV；质量扫描范围（m/z）33～700 amu；电子能量70 eV。

2.2.2 GC-MS分析

采用GC-MS法分析川续断挥发油的主要成分，采用峰面积归一化法计算各成分的相对含量。由表5可以得出，川续断挥发油中共检出46种化合物。所得的挥发油相对含量大于2%的化合物有棕榈酸（8.93%）、棕榈酸乙酯（4.22%）、亚油酸乙酯（3.91%）、亚麻酸乙酯（3.13%）、辛基棕榈酸酯（2.54%）、β-谷甾醇（10.51%）。其中，相对含量大于1%的化合物有亚油酸（1.90%）、硬脂酸乙酯（1.05%）、γ-谷甾醇（1.82%）、菜油甾醇（1.90%）、羊毛甾醇（1.04%）。

表5 GC-MS分析

2.3 抗氧化性试验

2.3.1 DPPH·抑制能力的测定

称取一定量的川续断挥发油，将川续断挥发油配制成0.50，1.00，2.00，4.00，8.00和16.00 mg/mL的系列梯度溶液，配制质量浓度0.08 mg/mL的DPPH·溶液。取2.0 mL DPPH·溶液和2.0 mL上述不同浓度的样品溶液混合均匀，避光静置30 min，通过紫外分光光度计在517 nm波长处测定吸光度（A1）；测定2.0 mL无水乙醇与2.0 mL不同浓度挥发油样品溶液混合液的吸光度（A2）；测定2.0 mL无水乙醇与2.0 mL DPPH·的吸光度（A0）。重复测定3次，取均值。抑制率按式（2）计算。

自由基抑制率=[1-（A1-A2）]/A0×100% （2）

2.3.2 ABTS+·抑制能力的测定

称取一定量的川续断挥发油，配制成0.25，0.50，1.00，2.00，4.00和8.00 mg/mL的系列梯度溶液，称取19.18 mg ABTS+·粉末，配制成质量浓度3.84 mg/mL的溶液，另称取3.10 mg K2S2O8粉末，配制成质量浓度0.62 mg/mL的溶液，2种溶液等体积混合，暗处反应12～14 h，取1.0 mL上述混合溶液，稀释约40倍，通过紫外可见分光光度计在734 nm波长处测试其吸光度，吸光度为0.700±0.02。取1.0 mL上述样品溶液，加入制备好的3.0 mL混合溶液，混合均匀，暗处反应10 min，测试吸光度（A2）；取1.0 mL样品溶液，加入3.0 mL乙醇溶液，混合均匀，测试吸光度（A1）；取1.0 mL混合溶液，加入3.0 mL无水乙醇，混合均匀，测试其吸光度（A0）。重复测定3次，取均值。抑制率按式（2）计算。

2.3.3 抗氧化性试验结果

由图6可知，川续断挥发油对DPPH·的抑制率随着川续断挥发油质量浓度的升高而增大，川续断挥发油质量浓度16.00 mg/mL时，其对DPPH·抑制率达83.4%±3.38%。由图7可知，川续断挥发油对ABTS+·的抑制率随着川续断挥发油质量浓度的升高而增大，川续断挥发油质量浓度4.00 mg/mL时，其对ABTS+·抑制率达100%±0.10%。试验表明所提取的川续断挥发油对2种自由基都具有较好的抗氧化性能。

图6 川续断挥发油对DPPH自由基的抑制作用

图7 川续断挥发油对ABTS+自由基的抑制作用

3 结论

在单因素试验基础上，结合正交设计试验，得出川续断挥发油萃取率最优设计方案。结果表明，无水乙醇作为携带剂，物料与携带剂比例1∶2.5（g/mL），萃取压力24 MPa，萃取温度40 ℃，萃取时间2.5 h，浸泡时间1.0 h时，超临界CO2萃取川续断挥发油最优萃取率达3.60%。根据GC-MS试验结果，川续断挥发油中共分离检测出46种化合物，主要成分包含醇、烯、酯及芳香物质等化合物类型，其中，棕榈酸和β-谷甾醇含量分别达8.93%和10.51%。抗氧化性试验表明，川续断挥发油具有DPPH·抑制能力和ABTS+·清除能力，且挥发油浓度与这2种自由基抑制率呈正相关关系。