APP下载

大米肽螯合物的体外抗氧化作用研究

2024-03-05刘建段升霞陈浏安张东立张大虎赵贵红

食品工业 2024年1期
关键词:螯合物螯合多肽

刘建,段升霞,陈浏安,张东立,张大虎,赵贵红

1.菏泽学院农业与生物工程学院(菏泽 274000);2.菏泽学院化工学院(菏泽 274000);3.山东大树达孚特膳食品有限公司(菏泽 274000)

矿物质元素钙、铁、锌等,不仅是酶的必需成分和激活剂,而且是维持人体生命活动和生长发育的一类具有生理功能的重要营养物质[1]。随着社会的发展以及人们饮食结构的不断变化,当前许多食物经过精深加工后导致维生素、矿物质等营养素的流失,造成人体中矿物质元素的缺失。另外,矿物质元素在小肠内的吸收模式也在一定程度上降低了其生物利用率[2]。根据《中国居民营养与健康状况》[3-4]监测报告显示:中国居民膳食钙摄入量低于平均需要量,城乡差别不大,提示绝大多数人群都存在着膳食钙摄入不足的风险;35.6%的居民锌的摄入量低于平均需要量,有摄入不足风险;居民中存在铁摄入不足风险的比例是11.5%。

矿物质元素的缺乏会引发一系列营养性疾病,如:儿童缺钙会得佝偻病;孕妇缺钙会得妊高征;老年人缺钙引起骨质疏松、骨质增生[5]。孕妇、快速成长期儿童,尤其是婴幼儿处于快速生长发育的阶段,对铁的需求量相对很大,普通饮食容易出现铁营养不良,会导致缺铁性贫血、抵抗力下降或精神不振等现象[6]。儿童缺锌会导致厌食、生长发育不良、免疫力下降、智力发育落后等严重后果。锌在人体内的吸收代谢受种种因素的限制,而锌缺乏已成为我国及许多发展中国家的公共卫生问题[7]。因此,及时地补充钙、锌、铁等人体所必需的矿物质元素,尤其对特殊人群如婴幼儿、儿童、青少年的生长发育,以及孕妇和乳母的健康都具有重要意义。

多肽-矿质元素螯合物作为一种新型的矿物元素补充剂越来越受到关注。当多肽和矿质元素形成螯合物之后,其能够借助肽在小肠内的吸收、转运特点以配合物的整体形式被主动吸收,进而提高无机态金属离子的生物利用率。另外,矿质元素与具有特殊生物活性的肽螯合后,螯合物仍具有抗氧化、抗菌、免疫调节、降血脂、降血糖等生物活性[8],因此在食品、医药、饲料添加剂等领域都具有非常重要的研究意义和应用价值。

肽钙螯合物作为新一代钙补充剂,它是钙二价离子以配位键及离子键和多肽结合形成的具有环状结构的络合物,这种螯合物既有利于微量元素以螯合物形式完整地被转运吸收,需要时又能有效地把钙离子释放出来。钙螯合肽被认为是改善钙生物利用度的新型功能性成分,目前,已有大量钙结合肽从各种食品资源中分离出来,如鱼骨[9]、乳清[10]、大豆[11]等。因此,多肽螯合钙必将成为补钙剂发展的趋势。多肽螯合铁是蛋白质水解生成的多肽与二价铁离子螯合而成的生物态铁,具有稳定性好、吸收率高、毒性小等优点,是一种理想的补铁剂。研究发现,多肽螯合铁可以大大提高铁离子的吸收率。王利[12]以猪血为主要原料制备了猪血红蛋白多肽螯合铁,抗贫血功能试验结果表明猪血红蛋白多肽螯合铁抗贫血效果明显优于氯化亚铁、葡糖糖酸亚铁,与氯化高铁血红素相当。邓尚贵等[13]以鳕鱼皮复合肽为原料,制备了鳕鱼皮-亚铁螯合物,并对其抗大鼠贫血效果进行了研究,结果表明,Fe-FPH对抗大鼠贫血有明显的效果。所以,多肽螯合铁可作为一种比较理想的补铁剂,用来改善缺铁性贫血等症状。同时,氨基酸和小肽具有促进锌吸收的作用,而且氨基酸或肽的金属复合体如铁、锌的生物学利用率比无机盐高且无毒副作用。因此,研究开发这种多肽螯合锌,具有十分重要的意义。

研究拟通过以大米肽为主要原料,制备富含钙铁锌三种营养素的大米肽螯合物。采用ABTS、DPPH自由基清除试验和还原力试验考察对比螯合原料和螯合物的体外抗氧化功能,对提高大米肽产品的品质和附加值、促进多肽螯合物及相关产业的进步与发展,具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料与时间

大米肽(山东大树达孚特膳食品有限公司);DPPH(纯度98%,上海源叶生物技术有限公司);氯化钙、硫酸锌、硫酸亚铁(分析纯)、ABTS(纯度98%)、过硫酸钾(纯度99%):上海麦克林生化科技有限公司;无水乙醇(烟台远东精细化工有限公司);三氯乙酸、氯化铁(天津市大茂化学试剂厂);铁氰化钾(天津市福晨化学试剂厂)。

1.2 主要仪器与设备

HH-8数显恒温水浴锅(金坛市盛蓝仪器制造有限公司);FA2004N电子天平(上海菁海仪器有限公司);V-1200型可见分光光度计(上海美析仪器有限公司);XK80-A快速混匀器(江苏新康医疗机械有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 大米肽的制备

大米蛋白粉→加水调制一定浓度→复合蛋白酶水解→灭酶→过滤→浓缩→喷雾干燥→包装成品

1.3.2 大米肽-钙、锌、铁螯合物的制备

根据文献[14-15]并进行适当调整。大米肽-钙螯合物:取5.5 g大米肽溶于100 mL去离子水中,充分搅拌混匀,加入1 g氯化钙;将混合物以超声波振荡器充分振荡均匀,以1 mol/L NaOH溶液调节混合溶液至pH 8.0,在40 ℃恒温水浴中孵育100 min。大米肽-锌螯合物:取4.0 g大米肽溶于100 mL去离子水中,充分搅拌混匀,加入1 g硫酸锌;将混合物以超声波振荡器充分振荡均匀,以1 mol/L NaOH溶液调节混合溶液至pH 5.0,在60 ℃恒温水浴中孵育100 min。大米肽-铁螯合物:取2.0 g大米肽溶于100 mL去离子水中,充分搅拌混匀,加入1.0 g硫酸亚铁和硫酸亚铁质量0.25%的抗坏血酸,防止抗氧化;将混合物以超声波振荡器充分振荡均匀,以1 mol/L NaOH 溶液调节混合溶液至pH 6.5,在35 ℃恒温水浴中孵育40 min。然后3种螯合物分别倒在4倍体积的无水乙醇中,经12 h静置沉淀,倒出上清液。将沉淀放在30 ℃鼓风干燥箱中,干燥成粉,得到大米肽螯合物。

1.3.3 抗氧化作用测定

1.3.3.1 DPPH·清除能力测定[16]

称取0.0059 g DPPH·(纯度为98%)放入250 mL的容量瓶中,用70%的乙醇定容,配成DPPH·工作液(浓度为0.06 mmol/L-1)。取不同浓度的0.5 mL样品溶液加入试管,分别加入5 mL DPPH·工作液混匀(对照管中则加0.5 mL的70%乙醇溶液,空白管中加0.5 mL的蒸馏水),吸光度测定波长为517 nm,在室温避光条件下放置30 min,测定吸光度,重复测定3次。

1.3.3.2 ABTS+·清除能力测定[16]

将0.192 g ABTS+·(纯度98%)与0.033 g过硫酸钾(纯度99%)分别溶解于50 mL蒸馏水中,等量混合均匀,室温黑暗处放置12~16 h,之后向母液中加入一定量的蒸馏水,溶液稀释至在波长734 nm处吸光度0.7±0.02,即为此次试验的ABTS+·工作液。取不同浓度的0.5 mL样品溶液加入试管,分别加入5 mL ABTS+·工作液混匀(对照管中则加0.5 mL的70%乙醇溶液,空白管中加0.5 mL的蒸馏水),吸光度测定波长为734 nm,在室温避光条件下放置10 min,测定吸光度,重复测定3次。

1.3.3.3 还原力的测定

将2.5 mL样品溶液与2.5 mL的蒸馏水、2.5 mL 1%的铁氰化钾溶液加入试管中充分混匀,在50 ℃的条件下孵育20 min,然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液,混匀后静置10 min。取2.5 mL试管中的混合溶液加入新试管,再加2.5 mL的蒸馏水和0.5 mL 0.1%的氯化铁溶液,充分混匀,测定其在波长700 nm下的吸光度,重复测定3次。将吸光度达到0.5所需要的有效浓度定义为A0.5。A0.5越小,表明样品的还原能力越强[17]。

2 结果与分析

2.1 大米肽分子量分析

根据文献[18]进行大米肽的分子量分布检测,结果表明肽含量为88.3±1.13 g/100 g样品。由表1可知,大米肽的分子量主要集中在1000 Da附近,分子量分布范围主要在200~2000 Da之间,用峰面积归一法计算得出分子量小于2000 Da的大米肽占总肽量的比例约为82.02%,分子量小于1000 Da的大米肽占总肽量一半以上(52.53%)。根据文献[19]进行大米肽的氨基酸组成分析,由表2可知,大米肽氨基酸含量最高的为谷氨酸,其次是天门冬氨酸、精氨酸、亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸等。多肽的抗氧化活性与其特定氨基酸组成以及氨基酸序列有密切关系,如组氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天门冬氨酸作为极性带电氨基酸,可以吸引带有异性电荷的自由基和金属离子,赋予肽抗氧化能力[20]。

表1 大米肽的相对分子质量分布

表2 大米肽的氨基酸组成分析 单位:g/100 g蛋白质

2.2 体外抗氧化活性试验

2.2.1 DPPH自由基清除能力的比较

截至目前,多项研究使用DPPH来检测功能活性化合物对自由基清除能力大小[21-23]。DPPH自由基是一种顺磁化合物,具有单电子,可接受抗氧化剂提供的一个单电子,从而形成稳定的DPPH-H化合物,同时自身颜色可从紫色逐渐变为黄色,因此在波长517 nm下吸光度的变化可反映出自由基清除程度[24-25]。大米肽及其螯合物清除DPPH自由基对比结果如图1所示。大米肽及其钙铁锌螯合物对DPPH自由基均具有一定的清除能力,且清除率随样品浓度的升高而升高(2~10 mg/mL)。其中,大米肽和大米肽螯合钙变化趋势较明显,几乎呈线性趋势,经拟合曲线公式计算得到大米肽和大米肽螯合钙对清除DPPH自由基的IC50值分别为6.35±0.66 mg/mL和10.05±2.61 mg/mL。大米肽螯合锌在样品浓度高于6 mg/mL后,对DPPH自由基清除率稳定在25%左右。大米肽螯合铁对DPPH自由基清除率的增加较平稳,在2 mg/mL时,即达到73.6%。结合图1可知,在同样浓度下,大米肽及其螯合物清除DPPH自由基的能力大小为大米肽螯合铁>大米肽>大米肽螯合钙>大米肽螯合锌。大米肽螯合钙和大米肽螯合锌清除DPPH自由基的能力小于大米肽,可能是由于螯合后,螯合物的结构相比于原料大米肽发生改变,进而导致氧化还原电势小于原料肽[26],而Fe2+可能与大米肽中的某些基团结合,其清除DPPH自由基的能力大于大米肽的大米肽螯合铁[21]。经计算,图2对照组VC清除DPPH自由基的IC50值为0.33±0.01 mg/mL,即VC清除DPPH自由基的能力明显高于大米肽及其螯合物。

图1 大米肽及其螯合物清除DPPH自由基对比图

图2 VC清除DPPH自由基对照图

2.2.2 ABTS自由基清除能力的比较

ABTS自由基清除试验同样是被广泛用于检测功能活性化合物抗氧化能力大小的方法之一。测定物与被氧化的ABTS反应后,通过颜色变化程度可测定被检测抗氧化能力强弱[27]。

大米肽及其螯合物清除ABTS自由基对比结果如图3所示。大米肽及其钙铁锌螯合物对ABTS自由基均具有较好的清除能力,且清除率随样品浓度的升高而升高(0.2~1.0 mg/mL)。其中,大米肽、大米肽螯合钙、大米肽螯合锌、大米肽螯合铁分别在0.2~0.8,0.2~0.6,0.2~0.8和0.2~1.0 mg/mL范围内变化趋势较明显,几乎呈线性趋势,经拟合曲线公式计算得到大米肽、大米肽螯合钙、大米肽螯合锌、大米肽螯合铁和VC对清除ABTS自由基的IC50值分别为0.61±0.01,0.54±0.04,0.92±0.01,1.08±0.02和1.03±0.01 mg/mL。结合图3和图4可知,在0.4~0.8 mg/mL范围内,大米肽及其螯合物清除ABTS自由基的能力大小为大米肽螯合钙>大米肽、大米肽螯合锌>大米肽螯合铁>VC。进一步分析,螯合后,大米肽螯合钙清除ABTS自由基的能力高于大米肽(0.2~1.0 mg/mL)、大米肽螯合铁清除ABTS自由基的能力,低于大米肽(0.4~1.0 mg/mL),大米肽螯合锌与大米肽清除ABTS自由基的能力区别不明显。在0.4~0.8 mg/mL范围内,大米肽、大米肽螯合钙、大米肽螯合锌、大米肽螯合铁清除ABTS自由基的能力均显著高于VC。

图3 大米肽及其螯合物清除ABTS自由基对比图

图4 VC清除ABTS自由基对照图

2.2.3 还原能力的比较

还原能力是抗氧化功能评价的一个重要指标。它是将三价铁还原为二价铁,以波长700 nm处的吸光度表示还原能力,吸光度的大小与化合物还原能力的强弱呈正比[28]。

大米肽及其螯合物还原能力对比结果如图5所示。由图5可知,大米肽及其钙铁锌螯合物均具有一定的还原能力,且还原能力随样品浓度的升高而升高(0.2~1.0 mg/mL)。其中,大米肽螯合钙和大米肽螯合铁变化趋势较明显,几乎呈正比例线性增加趋势,而大米肽和大米肽螯合锌线性增加趋势较平缓。在样品浓度为0.2 mg/mL时,大米肽的还原能力最强,高于大米肽螯合钙和大米肽螯合铁。在样品浓度0.6~1.0 mg/mL范围内,大米肽螯合钙和大米肽螯合铁的还原能力高于大米肽,而大米肽螯合锌的还原能力始终最低(0.2~1.0 mg/mL)。结合图6,大米肽及其螯合物还原能力均显著低于VC。

图5 大米肽及其螯合物还原能力对比图

图6 VC还原能力对照图

2.2.4 大米肽及其螯合物的红外光谱分析

红外光谱是用来分析有机化合物官能团组成的重要手段之一,能够反映出大米肽与钙锌铁螯合前后的配体基团变化情况[29]。大米肽及其螯合物的红外光谱见图7~图9。大米肽在3290 cm-1附近有宽吸收峰,是由N——H和OH的伸缩振动引起的[30]。大米肽在1658 cm-1处有吸收峰,这归因于C=O键的伸缩振动。当大米肽结合钙、锌、铁后,在该处的吸收峰分别移至1670,1662和1660 cm-1处,表明C=O键参与了钙、锌、铁这3种离子的结合[31]。与钙、锌、铁结合后,大米肽在1400 cm-1处的——COO谱带分别转移至1402,1411和1403 cm-1,这充分表明该——COOH与这3种金属离子成功结合,并且这种类型的螯合剂可能是由于未结合的自由电子所致[32]。另外,大米肽在1240 cm-1和1072 cm-1处的吸收峰可分别归结于C——N的拉伸振动和N——H的弯曲振动。与钙、锌、铁结合后,大米肽在N——H处的吸收峰分别转移至1079,1114和1080 cm-1,这再次表明含氮官能团与金属离子的成功络合。另外,大米肽结合钙、锌、铁后,分别在533,612和615 cm-1处出现了尖锐的吸收峰,这再次表明大米肽中羧基与金属离子的成功结合。综上,大米肽与钙、锌、铁的螯合后,形成了新的不同结构,其结构变化机理还需进一步分析。

图7 大米肽及大米肽螯合钙红外光谱图

图8 大米肽及大米肽螯合锌红外光谱图

图9 大米肽及大米肽螯合铁红外光谱图

3 结论

大米肽的分子量分布检测证明分子量小于1000 Da的大米肽占总肽量一半以上(52.53%),而大米肽氨基酸含量最高的为谷氨酸。通过ABTS、DPPH自由基清除试验和还原力试验考察对比大米肽及其螯合物的体外抗氧化功能,结果发现大米肽及其螯合物均表现出良好的体外抗氧化性,且均随着浓度的增加而上升。样品浓度在2~10 mg/mL,大米肽螯合铁清除DPPH自由基的能力高于大米肽;在0.4~0.8 mg/mL,大米肽螯合钙清除ABTS自由基的能力高于大米肽,且显著高于VC;在0.6~1.0 mg/mL,大米肽螯合钙和大米肽螯合铁的还原能力高于大米肽。红外光谱检测结果表明,正是由于大米肽与钙、锌、铁的螯合后,形成了新的不同结构,赋予了大米肽螯合物不同的体外抗氧化能力。文章证明了大米肽及其钙锌铁螯合物的体外抗氧化活性,并初步解析了其结构变化,对于提高大米肽产品的品质和附加值、促进多肽螯合物及相关产业的进步与发展,提供了理论基础。

猜你喜欢

螯合物螯合多肽
玉米低聚肽螯合铁(II)的制备和结构表征
不同结构的乌鳢螯合肽对抗氧化活性的影响
多肽-亚铁螯合物的研究进展
高多肽含量苦瓜新品种“多肽3号”的选育
微量元素氨基酸螯合物在肉鸡养殖业上的研究进展
抗HPV18 E6多肽单克隆抗体的制备及鉴定
微量元素─氨基酸螯合物及其在畜禽饲养中的应用
胎盘多肽超剂量应用致严重不良事件1例
螯合型洗涤助剂柠檬酸一氢钠与Ca2+离子螯合机理的理论研究
徐寒梅:创新多肽药物研究与开发