IL-10基因启动子区多态性和特应性皮炎易感性的相关性

钟连生,陈圆丹,陈晓艺,肖静,纪秀外,许锦华,高海媚

［作者单位］1.厦门市儿童医院,复旦大学附属儿科医院厦门医院皮肤科,福建 厦门 361006;2.福建省新生儿疾病重点实验室,福建 厦门 361006

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病,其发病机制目前尚未完全阐明,主要涉及遗传因素、皮肤屏障功能异常、环境因素、免疫异常以及皮肤表面菌群失调等[1]。近年来,大量的研究结果表明,遗传因素在AD的发病机制中起了非常重要的作用,超过70个基因可能和AD的发病相关,主要包括皮肤屏障功能相关基因、天然免疫相关基因、获得性免疫相关基因、编码来源于角质形成细胞的细胞因子相关基因、调节DNA甲基化相关基因、调节维生素D代谢途径相关基因等[2]。白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是一种具有抗炎作用的细胞因子,可以抑制细胞介导的免疫反应和炎症反应,国内外均有研究表明IL-10在AD患者中表达异常,和AD的发生发展密切相关[3-4]。本研究目的为探讨IL-10基因启动子区rs1800896、rs1800871和rs1800872位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)与厦门及周边地区儿童AD易感性的相关性。

1 对象和方法

1.1研究对象 选取2021年10月—2022年7月就诊于厦门市儿童医院皮肤科门诊的AD患儿130例,其中男64例,女66例,年龄(39.74±31.49)个月,所有患者均为厦门及周边地区的汉族儿童,均符合特应性皮炎的诊断标准(Williams标准),无其他皮肤病和系统性疾病。对照组为同期年龄和性别匹配的健康体检者141例,患有变应性鼻炎、哮喘、食物过敏等过敏性疾病者除外,其中男72例,女69例,年龄(41.45±29.68)个月。应用欧洲特应性皮炎评分标准(SCORAD),根据患儿皮损面积和严重程度进行评分:0～14分为轻度,15～40分为中度,41～83分为重度。家长对患儿瘙痒程度的评分方法采用瘙痒数字评定量表(NRS):0～10分,0分代表无瘙痒,10分代表可以想象到的最严重的瘙痒。所有患者均检测血清总IgE(TIgE),所有患者及健康对照者均检测血常规。AD患者组和健康对照组的人口统计学和临床特征具体见表1。所有患者及健康对照者的家长签署知情同意书,本研究经厦门市儿童医院医学伦理委员会审核并批准(批号:厦儿科伦审[2022]04号)。

表1 IL-10基因启动子区rs1800896、rs1800871和rs1800872位点外围扩增反应的引物序列

表2 IL-10基因启动子区rs1800896、rs1800871和rs1800872位点单碱基延伸反应的引物序列

1.2方法 所有患者及健康对照者均抽取EDTA抗凝外周静脉血2 mL,立即置-80 ℃低温冰箱储存备用。通过GenBank获得IL-10的基因序列,应用Primer 4.0软件进行引物设计。外围PCR扩增反应体系为25 μL,包括22 μL擎科1.1×T3 Super PCR Mix,1 μL正向引物,1 μL反向引物和1 μL DNA模板。反应条件为:98 ℃预变性2 min,然后98 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,35个循环后,72 ℃延伸5 min。SNaPshot多重单碱基延伸反应的反应体系为5 μL,包括2 μL ABI SnapShot multiplex Mix,2 μL混合引物,1 μL纯化后的PCR产物,反应条件为:96 ℃预变性2 min,然后96 ℃ 10 s,50 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共25个循环。取1 μL纯化后的延伸产物与10 μL HiDi混合物混匀,95 ℃变性5 min,-20 ℃冷却后,4 000 r/min离心,解冻、混匀后,上ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳测序。三个SNP位点所用的外围扩增引物序列及单碱基延伸引物序列见表1～2。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行统计分析。组间年龄差异采用t检验,性别、基因型和等位基因频率以及Hardy-Weinberg平衡采用卡方检验,采用Logistic回归分析基因型和等位基因频率与AD易感性之间的相关性,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1基本情况 AD患者组和健康对照组的人口统计学和临床特征具体见表3。对所有AD患儿进行SCORAD评分,结果示130例患者中,轻度42例,中度53例,重度35例。AD患者组和健康对照组的年龄和性别差异均无统计学意义(P>0.05),AD患者组嗜酸性粒细胞(EOS)计数显著高于健康对照组,差异有统计学意义(P=0.003)。

表3 患者组和对照组的人口统计学和临床特征

2.2IL-10基因启动子区各位点的基因型和等位基因频率与儿童AD易感性之间的相关性 在IL-10基因启动子区的rs1800896位点,基因型和等位基因频率在AD患者组和健康对照组之间的差异有统计学意义(P=0.007,0.003),两组在rs1800871和rs1800872位点的基因型及等位基因频率差异均无统计学意义(表4)。Logistic回归分析表明,在rs1800896位点,具有AA基因型的个体患AD的风险要显著高于GA基因型(P=0.003,OR=2.889,95%CI:1.447～5.769);具有A等位基因的个体患AD的风险要显著高于G等位基因的个体(P=0.003,OR=2.544,95%CI:1.364～4.745)(表4)。三个SNP位点各基因型的临床特征比较差异均无统计学意义(表5)。

表4 AD组和对照组IL-10启动子区rs1800896、rs1800871和rs1800872位点基因型和等位基因频率比较 例(%)

表5 rs1800896、rs1800871和rs1800872位点各基因型的临床特征比较

3 讨论

IL-10是一种重要的多效性细胞因子,主要表达于活化的单核细胞/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、肥大细胞、B细胞和调节性T细胞亚群[5]。该细胞因子具有强大的抗炎活性,在限制宿主对病原体的免疫应答中发挥重要作用,能够防止免疫反应对宿主造成损伤[6]。AD是一种慢性炎症性皮肤病,近年来,大量的研究表明,IL-10在特应性皮炎的发病机制中可能有重要的保护作用,如Niwa等[7]的研究表明,血清IL-10水平和AD的严重程度呈负相关;Yoshihara等[8]的研究表明,AD患者产生IL-10的调节性B细胞减少,且和疾病严重程度呈负相关;Seneviratne等[9]的研究则发现AD患者产生IL-10的抗原特异性CD4+T细胞减少,且和疾病严重程度呈负相关;但也有研究表明AD患者外周血单一核细胞及皮损内IL-10表达升高[10]。

人IL-10基因定位于染色体1q 31～32,包含4个内含子和5个外显子,长度约4.7 kb[11]。IL-10基因启动子区是高度多态性的,其中rs1800896(-1082A/G),rs1800871(-819T/C)和rs1800872(-592A/C)位点的SNP已被证明与IL-10的产生相关[12]。近年来,大量的研究表明,IL-10基因多态性和多种疾病的易感性相关,尤其是炎症反应相关性疾病,如哮喘[13]、银屑病[14]、炎症性肠病[15]、阿弗他口炎[16]等。截止目前,已有不少研究评估了IL-10基因启动子区rs1800896、rs1800871和rs1800872位点SNP与AD易感性之间的关系,但由于人种、地域、样本量、统计学方法、基因分型方法等方面的差异,不同的研究结果很不一致。印度[17]、捷克[18]、马其顿[19]、沙特阿拉伯[20]和意大利[21]有研究表明,rs1800896位点的多态性和AD的易感性相关;印度[17]、捷克[18]和韩国[22]有研究表明,rs1800871位点的多态性和AD的易感性相关;捷克[18]、意大利[21]和韩国[22]则有研究表明,rs1800872位点的多态性和AD的易感性相关。即使是都有相关性的同一位点,在不同国家的研究中,具体相关的基因型和等位基因也并不一致,如在rs1800896位点,捷克[18]的研究表明AA基因型患重度AD的风险显著增加,而马其顿[19]的研究则显示AG基因型患AD的风险显著增加。在我国,台湾地区的一项研究[23]表明,这三个位点的SNP和AD的易感性均无显著相关性。许银姬等[24]用Taqman探针法分析IL-10基因启动子区rs1800896、rs1800871和rs1800872三个位点的单倍型和基因型,发现健康对照组儿童ACC单倍型频率显著高于AD儿童组,对AD可能有保护作用。王生等[25]通过Sequenom MassARRAY SNP基因分型技术检测AD患者外周血IL-10基因的5个SNP位点(rs1554286、rs1518111、rs3021094、rs3024490和rs1800871)和AD的易感性,发现ATGAA单倍型和AD发病风险增加有关,GTTAA单倍型和AD发病风险降低有关。

本研究结果表明,IL-10基因启动子区rs1800896位点SNP可能与厦门及周边地区汉族儿童AD易感性相关,具有AA基因型的个体患AD的风险显著高于GA基因型;具有A等位基因的个体患AD的风险显著高于G等位基因的个体。rs1800871和rs1800872位点的SNP与AD的易感性则无明显相关性。三个SNP位点各基因型的临床特征比较差异均无统计学意义。近年来,有不少研究显示,IL-10基因多态性与一些疾病的严重程度相关[26-27],本研究在国内首次分析了IL-10基因启动子区多态性与AD的病情严重程度等临床特征的相关性,结果显示rs1800896、rs1800871和rs1800872三个位点的多态性和AD的病情严重程度、瘙痒严重程度和血清总IgE水平无明显相关性,笔者认为可能除遗传因素外,这些临床特征还会受到饮食、气候变化和汗液刺激等环境因素的影响。

本研究结果对未来AD易感人群的发现、AD的早期诊断和早期干预、AD的精准治疗和靶向药物研发以及指导个体化用药等方面可能具有重要意义。IL-10基因的其他功能性SNP位点有待进一步研究。由于本研究样本量较小,未来也还需要更大样本、多中心、多人种、多民族背景的研究以及相关基础实验来进一步阐明IL-10基因SNP在AD发病机制中的作用。