雷公藤甲素对大鼠卵巢氧化应激及颗粒细胞线粒体自噬的影响

严 谨，邓蒂斯，吴克明

(1.陕西中医药大学基础医学院,陕西 咸阳 712046;2.成都中医药大学附属医院妇科,四川 成都 610000)

雷公藤为卫矛科植物,中药以雷公藤根、叶及花入药,具有杀虫、消炎、解毒的功效。临床上常用雷公藤治疗风湿免疫性疾病[1]、慢性肾炎[2]、哮喘[3]等多种疾病。雷公藤甲素(triptolide,TP)是雷公藤的主要有效成分,属环氧二萜内酯化合物,也是引起不良反应的主要成分[4-7]。临床应用雷公藤制剂的主要不良反应有女性月经紊乱、闭经、卵巢功能减退等,因此,TP的生殖毒性一直备受关注,与此同时也给雷公藤制剂的临床应用带来巨大挑战。本课题组前期研究发现,采用TP 400 μg·kg-1·d-1的剂量连续灌胃60 d,可造成雌性育龄期大鼠卵巢功能减退[8-9]。但该造模法致大鼠卵巢功能减退的具体分子机制尚未完全阐明。本研究通过TP灌胃建立卵巢功能减退大鼠模型,观察TP对大鼠卵巢氧化应激、颗粒细胞线粒体自噬及卵巢功能的影响,旨在为雷公藤生殖毒性的防治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3月龄性成熟雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,体质量220～260 g,购自四川成都达硕生物科技有限公司,大鼠生产许可证号:SCXY(川)2020-030,使用许可证号:SYXK(川)2019-189。所有大鼠于室温22～25 ℃、相对湿度45%～65%、12 h/12 h明暗交替环境中分笼适应性喂养5 d,清洁级饲养。本研究通过陕西中医药大学伦理委员会审批,实验中严格执行所有伦理程序。

1.2 主要试剂与仪器

TP购自成都德思特生物技术有限公司,组织标本固定液购自福晨(天津)化学试剂有限公司,苏木精、伊红染液购自武汉塞维尔生物科技有限公司,抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)、雌二醇(estradiol,E2)、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone,FSH)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA )试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;Panthera数码三目摄像显微镜购自成都麦克迪奥有限公司,JEM-1400FLASH透射电子显微镜购自日本JEOL公司,徕卡-2016转轮式切片机、EM UC7超薄切片机购自德国徕卡公司,BMJ-A包埋机购自常州郊区中威电子仪器厂,SpectraMAX Plus384酶标仪购自上海美谷分子仪器有限公司,UPH-Ⅱ-10T优普超纯水制造系统购自成都超纯科技有限公司。

1.3 造模前合格动物筛选

将50只健康雌性SD大鼠于每日9:00行阴道脱落细胞涂片,光镜下观察每只大鼠动情周期(动情前期持续时间17～21 h,脱落细胞涂片上见大量有核上皮细胞和少量角化上皮细胞;动情期持续时间9～15 h,脱落细胞涂片上见大量角化上皮;动情后期持续时间10～14 h,脱落细胞涂片上见角化上皮和白细胞;动情间期持续时间 60～70 h,脱落细胞涂片上见大量白细胞)。连续观察2个动情周期,筛选出25只动情周期正常的大鼠为合格动物,以备后续实验使用。

1.4 动物分组及模型制备、鉴定

将筛选出的25只大鼠按随机数字表法分为空白对照组、实验1组、实验2组、实验3组和实验4组,每组5只。称取TP 0.025 g,置于 25 mL烧杯中,加入700 μL二甲基亚砜溶液和13.3 mL生理盐水搅匀备用,最终按照每只大鼠实际体质量将一定量的母液稀释后进行灌胃。实验1组大鼠每日给予400 μg·kg-1的TP灌胃1次,连续灌胃30 d;实验2组大鼠每日给予400 μg·kg-1的TP灌胃1次,连续灌胃40 d;实验3组大鼠每日给予 500 μg·kg-1的TP灌胃1次,连续灌胃30 d;实验4组大鼠每日给予 500 μg·kg-1的TP灌胃1次,连续灌胃40 d;空白对照组大鼠每日给予10 mL·kg-1蒸馏水灌胃1次,连续灌胃40 d。各组大鼠均于灌胃结束前第10天开始,每日9:00使用阴道灌洗法采集阴道脱落上皮细胞:移液枪吸取30 μL生理盐水,缓慢插入大鼠阴道内3～5 mm,吹打3～5次,见液体变浑浊,立即回抽;将每只大鼠的阴道回抽液制备2份阴道涂片,进行巴氏染色制片,光镜下观察,出现动情周期紊乱或延长确定造模成功。

1.5 ELISA法检测各组大鼠血清中AMH、E2、FSH水平

最后1次给药24 h后,各组大鼠腹腔注射3 g·L-1戊巴比妥钠(10 mL·kg-1)进行麻醉,腹主动脉取血,3 000 r·min-1离心3 min,取上清液,应用ELISA法检测血清中AMH、E2、FSH水平,严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察各组大鼠卵巢组织病理变化

取各组大鼠右侧卵巢,用体积分数10%中性甲醛固定,脱水,石蜡包埋,制作厚约4 μm切片。每只大鼠选3张切片,每张切片选择4个视野,在100倍镜下观察大鼠卵巢形态学变化,比较各组间大鼠卵泡数量、闭锁卵泡数量及颗粒细胞层脱落、坏死、囊性扩张等病理变化。

1.7 各组大鼠卵巢组织中SOD活性和MDA水平测定

取各组大鼠右侧卵巢组织,冰浴条件下加入生理盐水,匀浆5 min,3 000 r·min-1离心10 min,吸取上清液,采用SOD测定试剂盒检测SOD活性,MDA测定试剂盒检测MDA水平,首先配置酶工作液,再进行加样,最后混匀,37 ℃孵育20 min,采用酶标仪于 532 nm处检测各管吸光度值。

1.8 透射电子显微镜观察各组大鼠卵巢颗粒细胞线粒体形态结构变化及线粒体自噬情况

取各组大鼠左侧新鲜卵巢组织,戊二醛固定,树脂包埋,枸橼酸铅染色,风干后,采用JEM-1400PLUS透射电子显微镜观察颗粒层细胞线粒体形态、线粒体自噬情况。

1.9 流式细胞仪检测各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率

无菌条件下取各组大鼠左侧卵巢组织,置于预冷的无菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer solution,PBS)溶液中,去除周围脂肪组织、表面包膜,PBS清洗,置于预冷混合营养液F-12培养基中,用细针头刺破卵泡,在显微镜下将颗粒细胞释放入培养基中,反复吹打使之分散成为单个悬浮细胞。加入 0.25 g·L-1胰蛋白酶,于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中消化60 min,其间反复吹打2～3次,加入含有胎牛血清的培养液终止消化,过细胞筛,2 500 r·min-1离心5 min,洗涤,弃上清,收集细胞,1 500 r·min-1离心5 min,收集至1.5 mL离心管中,1 500 r·min-1离心5 min,加入不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化,1 500 r·min-1离心5 min,用PBS清洗2遍,按细胞凋亡检测试剂盒说明加入试剂,进行膜联合蛋白V-FITC/碘化丙啶染色,1 h内上流式细胞仪检测卵巢颗粒细胞凋亡率。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 5组大鼠血清中AMH、E2、FSH水平比较

与空白对照组比较,实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠血清中AMH、E2水平显著降低,FSH水平显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与实验1组比较,实验2组、实验3组、实验4组大鼠血清中AMH、E2水平显著降低,FSH水平显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。实验2组、实验3组、实验4组大鼠血清中AMH、E2、FSH水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 5组大鼠血清AMH、E2、FSH水平比较Tab.1 Comparison of serum AMH,E2 and FSH levels of rats among the five groups

2.2 5组大鼠卵巢组织病理变化

空白对照组大鼠卵巢组织被膜完整,皮质区原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡等数量较为正常,各级卵泡发育正常,闭锁卵泡少见,黄体数量较少;髓质区纤维结缔组织排列紧密,未见明显水肿或坏死。与空白对照组相比,实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢组织可见卵泡数量减少,闭锁卵泡增多,颗粒层卵泡细胞坏死、脱落和卵泡囊性扩张等病理改变。实验1组大鼠卵巢组织病理改变程度相对较轻,闭锁卵泡少,颗粒层细胞坏死不多;实验4组大鼠卵巢组织病变程度相对最重,可见较多闭锁卵泡和颗粒细胞层坏死、脱落;实验2组、实验3组大鼠卵巢组织病变程度相对轻于实验4组,闭锁卵泡较少,颗粒细胞层不同程度坏死和卵泡囊性扩张。结果见图1。

A:空白对照组;B:实验1组;C:实验2组;D:实验3组;E:实验4组。

2.3 5组大鼠卵巢组织中SOD活性及MDA水平比较

与空白对照组比较,实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢组织中SOD活性显著降低,MDA水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与实验1组比较,实验2组、实验3组、实验4组大鼠卵巢组织中SOD活性显著降低,MDA水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。实验2组、实验3组、实验4组大鼠卵巢组织中SOD活性、MDA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。

表2 5组大鼠卵巢组织中SOD活性及MDA水平比较Tab.2 Comparison of SOD activity and MDA levels in ovarian tissue of rats among the five groups

2.4 5组大鼠卵巢颗粒细胞线粒体形态、结构及线粒体自噬情况

空白对照组大鼠的卵巢颗粒细胞形态结构正常,细胞核呈不规则多边形,染色质分布均匀,以常染色质为主,核膜清晰完整,细胞质中可见线粒体等细胞器且结构完整清晰(图2A)。实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢颗粒细胞细胞质中可见不同程度的线粒体自噬(红色箭头所示),实验2组、实验3组、实验4组大鼠线粒体自噬程度重于实验1组,实验3组、实验4组大鼠线粒体自噬程度重于实验2组,实验3组与实验4组大鼠粒体自噬程度相当,其中实验3组和实验4组电镜下可见卵巢颗粒细胞细胞质中含较多线粒体自噬小体,多数线粒体发生轻度肿胀,部分线粒体嵴结构消失,粗面内质网扩张呈囊状(图2B、图2C、图2D、图2E)。

A:空白对照组;B:实验1组;C:实验2组;D:实验3组;E:实验4组。↑:该红色箭头处代表自噬小体,表明出现线粒体自噬。

2.5 5组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率比较

空白对照组、实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率分别为(6.23±2.49)%、(18.53±11.19)%、(20.29±8.34)%、(21.38±8.24)%、(28.48±11.66)%。实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率均显著高于空白对照组,实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于实验1组,实验3组、实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于实验2组,实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于实验3组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图3。

3 讨论

临床上雷公藤制剂常应用于抗肿瘤、风湿免疫性疾病等领域,TP是雷公藤的主要有效成分,TP生殖毒性日渐成为阻碍其进一步发展的重大障碍。TP生殖毒性在女性主要见于卵巢功能减退,具体表现为月经周期紊乱、闭经及卵巢功能早衰等。卵巢功能减退是指卵巢内可募集卵泡数量减少和质量降低,并伴随低雌激素及高促性腺激素,临床表现为月经紊乱或闭经,生育力降低或不孕。近年来,卵巢功能减退类疾病发病率增高[10],其成为女性生殖医学研究的重点和热点[11]。该类疾病的病因和病理机制尚未完全阐明,且无特效治疗药物,使用TP建立卵巢功能减退大鼠模型可为深入研究该疾病的发病机制提供有效的动物模型。近年临床研究发现,卵巢功能减退女性的卵巢颗粒细胞中线粒体DNA数量和结构改变,进而导致线粒体功能障碍,是颗粒细胞凋亡即卵泡闭锁的主要原因[12]。线粒体自噬可通过清理受损伤的线粒体来保护颗粒细胞的结构和功能正常。既往动物实验研究表明,卵巢内氧化应激的累积会造成卵巢内分泌失调[13],氧化应激发生后,颗粒细胞凋亡亦随之增加,由此引发更多卵泡闭锁[14]。线粒体为细胞代谢、细胞周期和细胞信号转导提供ATP,发生卵巢氧化应激后,线粒体内膜通透性增加、膜电位下降,导致氧化磷酸化受损,出现能量代谢障碍,此时线粒体发生肿胀[15-16];随着线粒体结构异常,线粒体功能障碍进一步加重[17]。因此,在TP诱导的卵巢功能减退大鼠模型中,药物剂量和作用时间是否与模型大鼠的卵巢损害成正比、TP是否参与诱导颗粒细胞氧化应激损伤、线粒体功能障碍及线粒体自噬等问题亟待明确。

本研究通过TP灌胃,成功构建了大鼠卵巢功能减退模型,并根据TP灌胃剂量和给药时间的不同,将其分为空白对照组、实验1组(400 μg·kg-1·d-1TP,连续30 d)、实验2组(400 μg·kg-1·d-1TP,连续40 d)、实验3组(500 μg·kg-1·d-1TP,连续30 d)和实验4组(500 μg·kg-1·d-1TP,连续40 d),结果显示,与空白对照组相比,实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠血清中AMH、E2水平显著降低,FSH水平显著增高,说明TP可通过影响大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴的内分泌功能,造成卵巢内分泌功能紊乱和卵巢储备功能下降。从数据上来看,实验2组、实验3组、实验4组大鼠血清中AMH、E2水平呈下降趋势,FSH水平呈上升趋势,但实验2组、实验3组、实验4组大鼠血清中AMH、E2、FSH水平比较差异无统计学意义,可能是纳入的样本量较少所致。另外,本研究结果发现,与空白对照组相比,实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢组织卵泡数量减少,闭锁卵泡增多,颗粒层卵泡细胞坏死、脱落和卵泡囊性扩张;其中实验1组大鼠卵巢组织病理改变程度相对较轻,闭锁卵泡少,颗粒层细胞坏死不多;实验4组大鼠卵巢组织病变程度相对最重,可见较多闭锁卵泡和颗粒细胞层坏死、脱落;实验2组和实验3组大鼠卵巢组织病变程度相对轻于实验4组,闭锁卵泡较少,颗粒细胞层不同程度坏死和卵泡囊性扩张。以上结果表明,TP剂量和干预时间与卵巢组织损伤有关;TP造成大鼠卵巢功能减退以卵巢内卵泡数量减少、闭锁卵泡增加并伴随低E2和高促性腺激素为特征,AMH降低进一步证实了卵巢储备功能的降低。

另外,本研究结果显示,随着TP剂量的增加和给药时间延长,各实验组大鼠卵巢氧化应激损伤逐渐加重,其中与空白对照组比较,实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢组织SOD活性显著降低、MDA水平显著增高,且透射电镜观察发现,与空白对照组相比,实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢颗粒细胞的细胞质中均可见不同程度的线粒体自噬;与实验1组比较,实验2组、实验3组、实验4组大鼠卵巢组织SOD活性显著降低,MDA水平显著升高,且实验2组、实验3组、实验4组大鼠线粒体自噬程度重于实验1组;实验2组、实验3组、实验4组大鼠卵巢组织SOD及MDA水平比较差异无统计学意义,但实验3组、实验4组大鼠线粒体自噬程度重于实验2组,而实验3组与实验4组自噬程度相当;以上结果提示,TP可造成卵巢氧化应激损伤和线粒体自噬增加,其损伤可能与TP作用时间和剂量有关,随着氧化应激损伤加重,线粒体自噬程度亦逐步增加;但实验3组与实验4组的颗粒细胞内线粒体自噬水平基本持平,说明线粒体自噬到达一定程度后,不再随着TP干预时间的继续增加而持续增强。本研究结果显示,实验1组、实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率均显著高于空白对照组,实验2组、实验3组和实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于实验1组,实验3组、实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于实验2组,实验4组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于实验3组;提示,TP最终可造成卵巢颗粒细胞凋亡,卵巢颗粒细胞凋亡率与TP作用时间和剂量有关。

4 结论

采用TP灌胃给药可成功构建大鼠卵巢功能减退模型,TP剂量和干预时间与卵巢组织损伤有关。随着TP剂量和干预时间的增加,大鼠卵巢氧化应激水平逐渐增高,颗粒细胞内线粒体肿胀、线粒体嵴消失的程度逐渐加重,线粒体自噬增加。TP诱导的卵巢氧化应激损伤可能是引发卵巢功能低下的重要因素,其作用机制可能是通过卵巢氧化应激影响卵巢内分泌功能和诱导颗粒细胞凋亡等病理生理过程而完成。卵巢颗粒细胞线粒体自噬虽然能清除氧化应激损伤,但随着氧化应激的累积,超出机体自噬清除能力,线粒体自噬到达一定程度后不再随着TP干预时间的继续增加而持续增强,此时卵巢损伤则进行性加重,最终造成不可逆性损害。