木糖合成纳米木聚糖在抗菌材料中的应用研究

王举伟 张嘉俊 刘思佳 李 冰 李慧杰 庞久寅

（北华大学木质材料科学与工程重点实验室，吉林省吉林市 132013）

作为农业生产大国，我国每年会产生大量的农业废弃物，而这些农业废弃物中含有丰富的生物质资源[1-2]。若能对其有针对性地进行转化利用，则可以获得重要的新材料、化工原料、高热值燃料、功能食品和药物等[3-4]。因此，生物质精炼已成为经济和社会发展的重大战略举措[5]。

抗菌材料是近年来材料科学领域的一大亮点[6]，根据其来源、理化性能和抗菌机理，可分为无机抗菌剂、有机抗菌剂和天然抗菌剂3大类[7-9]。

无机抗菌剂的抗菌效果具有广谱性、持久性、耐热性、不产生细菌耐药性等优点，主要分为金属类和碳材料类。有机抗菌剂的杀菌效率高，合成方法简单，种类多样，是一类常见的抗菌剂，在市场中占据主导地位[10]。天然抗菌剂主要通过一些生物体合成，根据其来源可分为植物源、动物源及微生物源抗菌剂[11-13]。

这些抗菌剂各有优缺点，大量使用无机抗菌剂容易在环境中积累并产生污染，对水生生物和土壤微生物会造成不良影响，也可能产生抗性菌株，使抗菌剂的效果逐渐减弱[8]。长期使用有机抗菌剂则可能造成环境污染和人体健康问题。天然抗菌剂的缺点在于提取成本较高，容易被污染或发生变质。

木糖是戊糖的一种，主要分布于植物体内，如玉米的穗轴、秸秆，以及棉桃的外皮等。因此，以农业废弃物为原料，开发新型、低毒、高效的纳米木聚糖抗菌剂是一个值得深入研究的课题[14-16]。

鉴于此，本研究采用高温缩聚法[17]，使木糖在山梨醇与柠檬酸的作用下，聚合成低聚木糖，并用于制备纳米木聚糖。在此基础上，考察纳米木聚糖的抑菌效果，以期为天然抗菌剂的开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

木糖（化学纯，山东新华制药有限公司）、山梨醇（化学纯，江苏诚信生物科技有限公司）、柠檬酸（化学纯，山东新华制药有限公司）、氢氧化钠（化学纯，山东新华制药有限公司）、硫酸（分析纯，山东新华制药有限公司）、无水乙醇（工业级，山东新华制药有限公司）、胰蛋白胨（试剂级，江苏诚信生物科技有限公司）、酵母提取物（江苏诚信生物科技有限公司）、氯化钠（分析纯，山东新华制药有限公司）、琼脂（食品级，江苏诚信生物科技有限公司）、蒸馏水（山东新华制药有限公司）。

1.2 试验仪器与设备

电热恒温水浴锅（HH-1），金坛市富华仪器有限公司；数显多头磁力加热搅拌器（HJ-6A），常州市亿能实验仪器有限公司；分析天平（TG328A），上海天平仪器厂；高速离心机（HC-3514），安徽中科中佳科学仪器有限公司；高速多功能粉碎机（HL-FS400），上海寰熙医疗器械有限公司；电热鼓风干燥箱（DL102），天津市实验仪器厂；真空冷冻干燥机（BK-FD12T），山东博科生物产业有限公司；紫外分光光度计（UV-1200），上海美析仪器有限公司；傅里叶红外光谱仪（FTIR-1500），中世沃克科技发展股份有限公司；纳米激光粒度仪（Winner802），济南微纳仪器股份有限公司；立式蒸汽灭菌锅（BKQ-B5011）， 山东博科生物产业有限公司；恒温恒湿培养箱（BSC250），上海博讯实业有限公司。

1.3 木糖合成低聚木糖

称取适量山梨醇和柠檬酸，分别加入少量蒸馏水溶解。称取27 g木糖，将山梨醇溶液与木糖混合均匀，倒入三颈烧瓶，加热升温至90 ℃，转速20 r/min。在升温的同时缓慢加入柠檬酸溶液，持续加热30 min，使其充分融化呈透明淡黄色，升温至140～170 ℃，转速调至40 r/min，持续反应1 h。待反应结束后将药品取出，冷却至室温。

1.4 纳米木聚糖的制备

称量2 g木聚糖，加入一定浓度氢氧化钠溶液200 mL，在一定温度下（40～80 ℃）进行溶解。反应一段时间后，降至室温，加入事先稀释好的硫酸调节pH至5.5。加入3倍体积95%乙醇进行醇沉，醇沉24 h；将醇沉后的样品进行抽滤，并使用蒸馏水对沉淀物洗涤2～3次。随后再沉淀加入适量蒸馏水并进行离心，转速为6 000 r/min，时间3 min，重复离心3 次，确保除尽乙醇。将离心后的样品取出，过滤液体，将滤渣放入冰箱预冻一段时间，确保能够结块。随后，将预冻好的样品放入真空冷冻干燥机中干燥24 h，即可获得纳米木聚糖[18-21]。

1.5 抗菌性能测试

参考GB/T 38483—2020《微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定抑菌圈法》对纳米木聚糖的抗菌性能进行测试[22]。

LB液体培养基：称取胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化钠10.0 g，然后将上述各成分加于1 000 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2，分装至锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min。

LB固体培养基：称取胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化钠10.0 g、琼脂20.0 g，然后将上述各成分加于1 000 mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.0±0.2，分装至250 mL锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min。

采用纸片扩散法[23-24]，用打孔器将滤纸加工成若干小圆片，在紫光灯下充分照射，确保无杂菌，用于承载样品。以蒸馏水为溶剂，配制纳米木聚糖溶液。另外选用未经任何处理的空白试样作为对照组。

菌株活化：将菌株接种到LB液体培养基的试管中，37 ℃下培养12 h。用接种环挑取菌悬液以划线法接种到LB固体平板上，37 ℃恒温培养箱中培养24 h，然后从平板中挑取单菌落接种在LB固体培养基试管斜面内，37 ℃恒温培养箱中培养24 h。

菌悬液制备[25-27]：用接种环取保存菌，以划线法接种到LB固体平板上，37 ℃下培养24 h。取LB液体培养基20 mL加入容量为100 mL的无菌锥形瓶内，用接种环取平皿上的单菌落接种在LB液体培养基内，37 ℃培养12 h。菌悬液用冷却至55 ℃左右的LB固体培养基按1∶10的比例稀释，充分混匀后取15 mL于无菌培养皿内，使用滚珠法将其均匀铺开，待其凝固后制成检测平板备用。将小圆片以一定间距摆放在平板上，在小圆片上滴加适量样品溶液，将平板正置于37 ℃的恒温培养箱中培养12 h取出。

1.6 红外光谱（FT-IR）分析

利用中世沃克公司的傅里叶变换红外光谱仪(FTR-1500)测试样品的红外光谱，采用KBr压片法制备，背景选用空气。取适量测试样品研磨成粉末，将粉末与KBr混合压片，测试范围为3 500～500 cm-1。图1 为纳米木聚糖的红外光谱图。由图可知，纳米木聚糖在3 418 cm-1附近出现的特征吸收峰归因于多糖O—H的伸缩振动；2 900 cm-1处是甲基、亚甲基等的C—H的伸缩振动吸收峰；1 617 cm-1处为木糖单元的C—C伸缩振动吸收峰；1 180～1 050 cm-1内的振动吸收峰源于吡喃环的C—O 、C—O—C的伸缩振动与C—O—H的伸缩振动叠加的结果；1 145 cm-1附近处的强吸收峰证明单糖以吡喃糖苷的形式存在；996 cm-1处为吡喃糖B-型C—H变角振动的特征峰。综合红外光谱特征可知，纳米木聚糖的糖链主要以β糖苷键连接，并且其糖环为吡喃环。

图1 纳米木聚糖的红外光谱Fig.1 Infrared spectroscopy of nanoxylan

1.7 核磁共振氢谱（¹HNMR）分析

利用日本电子JEOL公司的JNM-ECZS核磁共振波谱仪对样品进行测定和确证，使用重水（D2O）做氘代试剂。

图2 为纳米木聚糖的¹HNMR谱图。理论上，氘水的溶剂峰和水峰在4.79 ppm，而在此图中，溶剂峰在4.6 ppm处。其中，5.3 ppm处出现的单峰为叔碳上H的质子吸收峰，5.0～5.5 ppm出现的多重峰为木聚糖上羟基的质子吸收峰，4.0 ppm处出现的单重峰为叔碳上H的质子吸收峰，3.0～4.0 ppm处出现的多重峰为分子中与羟基相连的叔碳上H的质子吸收峰和分子中亚甲基的质子吸收峰。

图2 纳米木聚糖的¹HNMR谱图Fig.2 ¹HNMR spectra of nanoxylan

2 结果与分析

2.1 低聚木糖的合成分析

如表1 所示，采用正交试验法来确定木糖合成低聚木糖的优化工艺，其方差分析如表2 所示。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Orthogonal test factor level table

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

低聚木糖一般在2～7 个聚合度，此反应中山梨醇作为增塑剂可以与木糖结合形成山梨醇-木糖产物，促进低聚木糖的形成。此外，山梨醇还能增加反应混合物的黏度，提高反应的分子浓度，从而促进反应进行。同时，山梨醇也是终止剂，对于控制聚合度，最直观的反应就是产物的颜色。当产物偏向深黄色时，则聚合度过大，原因在于柠檬酸作为催化剂与交联剂，其中含有多个羧基，可能会干扰反应产物的稳定性并加剧聚集，对产物的生成具有显著影响。因此，合成低聚木糖时木糖、山梨醇、柠檬酸的最佳用料比为18 ∶6 ∶1，处理温度为170 ℃。

2.2 纳米木聚糖的合成分析

如表3所示，采用正交试验来确定制备低聚木糖的优化工艺，其方差分析如表4所示，粒径情况如图3所示。

表3 正交试验因素水平表Tab.3 Orthogonal test factor level table

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

图3 纳米木聚糖粒径测试Fig.3 Nanoxylan particle size test

从方差分析结果可以看出，3种因素中，碱液浓度的影响最显著，其均方数F值达到了5.21，p值小于显著性水平0.05，说明对粒径有显著影响。而温度和时间的p值均大于0.05，说明对粒径没有显著影响。因此，优化工艺为碱液浓度为3.5%，处理时间为2 h，处理温度为60 ℃，该条件下制备的纳米木聚糖其粒径较小。

2.3 抗菌性能分析

图4～6为不同组的金黄色葡萄球菌抑菌测试结果，右侧2个为滴加了纳米木聚糖溶液的纸片。由图可知，木聚糖对照组在金黄色葡萄球菌中抑菌圈直径为8 mm，纳米木聚糖试验组在金黄色葡萄球菌中抑菌圈直径为11 mm，抗菌性能相对提升37.5%。

图4 空白对照组Fig.4 Blank control group

图5 木聚糖对照组Fig.5 Xylan control group

图6 纳米木聚糖对照组Fig.6 Nanoxylan control group

图7～9为不同组的大肠杆菌抑菌测试结果，右侧2个为滴加了纳米木聚糖溶液的纸片。由图可知，木聚糖对照组在大肠杆菌中抑菌圈直径为9 mm，纳米木聚糖试验组在大肠杆菌中抑菌圈直径为12 mm，抗菌性能相对提升30%。

图7 空白对照组Fig.7 Blank control group

图8 木聚糖对照组Fig.8 Xylan control group

图9 纳米木聚糖对照组Fig.9 Nanoxylan control group

3 结论

本文以木糖、山梨醇、柠檬酸为原理，以高温聚合法制备了低聚木糖；随后将其与氢氧化钠溶液混合反应，制备得到了纳米木聚糖。在此基础上，考察了纳米木聚糖的抑菌效果，主要得出以下结论：

1）低聚木糖的优化制备工艺为：木糖、山梨醇、柠檬酸的物料比18 ∶6 ∶1，处理温度为170 ℃，处理时间为1 h。纳米木聚糖的优化制备工艺参数为碱液浓度3.5 %，处理温度为60 ℃，处理时间为2 h，纳米木聚糖平均粒径可达126 nm左右。

2）木聚糖本身具有一定的抗菌性，纳米化后抗菌性能更佳。一方面，可能是因为细菌表面对于多糖具有一定的识别性；另一方面，在纳米化后，木聚糖对细菌的细胞膜、细胞壁、酶和代谢等产生了干扰作用，从而显示出良好的杀菌效果。