那屈肝素钙中N-NO的去除方法研究

郑华淦,廖 冬,曲和之

(深圳赛保尔生物药业有限公司,广东 深圳 518129)

肝素是从猪小肠黏膜中提取的一种硫酸化糖胺聚糖类化合物,重均分子量为15 000～19 000[1],其分子结构极其复杂,至今无法人工合成。肝素具有迅速抗凝作用,临床上主要用于预防和治疗血栓栓塞性疾病及血液透析抗凝,在非抗凝领域也有广阔的应用前景[2]。低分子肝素是由普通肝素经化学法或酶法裂解制得,与普通肝素相比,其抗Ⅹa因子与抗Ⅱa因子的效价比更高,能减少抗血栓过程中的出血副作用,因此得到更广泛的应用[3]。欧洲药典(EP)根据不同工艺将低分子肝素分为那屈肝素钙、达肝素钠、依诺肝素钠、帕肝素钠和汀肝素钠[4]。其中那屈肝素钙的重均分子量为3 600～5 000,取代基有多种可能性,结构复杂,其结构式见图1。

图1 那屈肝素钙的结构式Fig.1 Structural formula of Nadroparin Calcium

那屈肝素钙通过亚硝酸裂解得到,因此当肝素糖链上R1为CO-CH3时可能引发一些副反应,仲胺的N与亚硝基形成亚硝胺杂质,含有N-NO基团(图2)。2021年2月,美国食品药品监督管理局(FDA)更新了《人用药品中亚硝胺杂质的控制》指南[5],指出在各类药物中发现的亚硝胺杂质有可能是人类致癌物,需对药品中的潜在亚硝胺杂质进行风险评估,并采取适当的措施以减少或预防原料药和药物中亚硝胺杂质的存在。我国国家药品监督管理局药品审评中心也指出,亚硝胺是一种强致癌物,应充分评估药品中亚硝胺类杂质的风险,并将亚硝胺类杂质水平控制在安全限度以下[6]。EP10.0规定那屈肝素钙中的N-NO含量应≤0.25 μg·g-1。目前,未处理的那屈肝素钙中N-NO含量远高于EP要求,因此需寻找一种简易有效的方法去除N-NO,使最终产品合格。为此,作者分别采用氧化法、加热法、微波照射法、紫外照射法处理那屈肝素钙粗品,比较N-NO去除效果,进行工艺验证及方法学验证,为高效去除那屈肝素钙中N-NO提供帮助。

图2 生成亚硝胺的典型反应式Fig.2 Representative reaction of nitrosamine formation

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

那屈肝素钙粗品,深圳赛保尔生物药业有限公司。

30%双氧水,分析纯,西陇科学股份有限公司;盐酸、氢氧化钠,药用级,湖南尔康制药公司;乙醇,药用级,安徽安特食品公司。

TEA-810型热能分析仪,英国Ellutia公司;HJ-3型恒温磁力搅拌器,常州国华电器有限公司;AB204-S型电子天平、S20型 pH计,梅特勒-托利多公司;BPZ-6063型真空干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;Q6(P0)型微波炉,格兰仕公司;E-6型紫外杀菌器,上海信晨水处理设备有限公司。

1.2 N-NO去除方法研究

取3批那屈肝素钙粗品(编号1#、2#、3#),测定初始N-NO含量,样品编号:NQ-01-0、NQ-02-0、NQ-03-0;再分别开展氧化法、加热法、微波照射法、紫外照射法去除N-NO实验。

1.2.1 氧化法

称取1#、2#那屈肝素钙粗品各8 g,分别用48 mL水溶解后加入0.8 mL 30%双氧水,室温氧化24 h;加入200 mL乙醇,搅拌析出沉淀,过滤,真空干燥,得到约7.6 g样品,样品编号:NQ-01-1、NQ-02-1。

1.2.2 加热法

称取1#、2#那屈肝素钙粗品各8 g,分别用48 mL水溶解后用6 mol·L-1盐酸调节pH值至4.5左右,加热至50 ℃,保持0.5 h;再用2 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至10左右,加热至75 ℃,保持0.5 h;降至室温,用6 mol·L-1盐酸调节pH值至6.5～7.0;加入200 mL乙醇,搅拌析出沉淀,过滤,真空干燥,得到约7.8 g样品,样品编号:NQ-01-2、NQ-02-2。

1.2.3 微波照射法

称取1#、2#那屈肝素钙粗品各8 g,分别用48 mL水溶解后微波照射5 min(分次,每次10～20 s后静置,水冷后继续,避免过热);加入200 mL乙醇,搅拌析出沉淀,过滤,真空干燥,得到约7.8 g样品,样品编号:NQ-01-3、NQ-02-3。

1.2.4 紫外照射法

称取1#、2#那屈肝素钙粗品各200 g,分别用1 200 mL水溶解,利用蠕动泵使料液流经紫外杀菌器,打开循环,并打开紫外灯(254 nm)照射10 min,关闭紫外灯,放料;分别取样48 mL,加入200 mL乙醇,搅拌析出沉淀,过滤,真空干燥,得到约7.8 g样品,样品编号:NQ-01-4、NQ-02-4。

1.2.5 紫外照射法进一步研究

称取3份(A组、B组、C组)3#那屈肝素钙粗品各200 g,分别用1 200 mL水溶解,用蠕动泵使料液流经紫外杀菌器,打开循环,并打开紫外灯(254 nm)照射;分别间隔不同时间,取样48 mL,每组取样5个,共计15个样品,分别加入200 mL乙醇,搅拌析出沉淀,过滤,真空干燥,得到约7.8 g样品。

1.3 N-NO含量测定方法验证

参照《中华人民共和国药典》2020年版四部[7],对热能分析仪[8]测定N-NO含量的方法进行方法学验证。

2 结果与讨论

2.1 不同方法对N-NO的去除效果比较(表1)

表1 不同方法对N-NO的去除效果比较Tab.1 Comparison of removal effects of N-NO in Natroparin Calcium by different methods

由表1可知,采用氧化法、加热法、微波照射法均只能去除约50%的N-NO,而采用紫外照射法可以去除约95%的N-NO。因此,采用紫外照射法开展进一步研究。

紫外照射不同时间的样品编号及样品中N-NO含量见表2,N-NO含量随紫外照射时间的变化曲线见图3。

表2 紫外照射不同时间的样品编号及样品中N-NO含量Tab.2 Number and N-NO content of samples irradiated different time

图3 N-NO含量随紫外照射时间的变化曲线Fig.3 Change curve of N-NO content with UV irradiation time

由表2可知,采用紫外照射法去除N-NO的速度先快后慢:照射0～10 min时N-NO含量下降较快,从14.25 μg·g-1降至0.83 μg·g-1(A组);照射10～20 min时N-NO含量下降缓慢,从0.96 μg·g-1降至0.23 μg·g-1(B组);照射20～90 min时N-NO含量几乎不变,在0.21～0.23 μg·g-1之间(C组)。 由此可见,紫外照射20 min能有效去除N-NO,N-NO含量符合EP要求(≤0.25 μg·g-1)。

紫外照射90 min后那屈肝素钙的关键指标见表3。

表3 紫外照射90 min后那屈肝素钙的关键指标Tab.3 Key indexes of Nardraparin Calcium after 90 min UV irradiation

由表3可知,紫外照射90 min对那屈肝素钙无不良影响,关键指标如分子量与分子量分布、抗Ⅹa因子效价等基本不变。考虑到不同批次间可能存在的差异,将那屈肝素钙生产工艺中的紫外照射时间定为20～60 min。

2.2 工艺验证

按紫外照射20～60 min的方法连续生产3批那屈肝素钙产品,批号分别为20210902(照射20 min)、20210903(照射40 min)、20210904(照射60 min),测得N-NO含量分别为0.19 μg·g-1、0.20 μg·g-1、0.21 μg·g-1,表明3批那屈肝素钙产品均符合EP要求。

2.3 方法学验证

对测定N-NO含量的热能分析仪法进行方法学验证,结果见表4。

表4 N-NO含量测定方法的方法学验证结果Tab.4 Methodology verification results for determination of N-NO content

由表4可知,该方法适用于那屈肝素钙中N-NO含量的测定。

2.4 讨论

综上,采用氧化法、加热法、微波照射法难以去除那屈肝素钙产品中的N-NO,而紫外照射20～60 min可以有效去除,使那屈肝素钙产品符合EP要求,且长时间紫外照射对关键指标无影响。研究表明,紫外照射法去除N-NO可能存在3条路径,即光致水解、光致消去和光氧化[9]。光致水解需在弱酸条件下进行,而本研究中紫外照射的溶液pH值接近中性,且采用单波长254 nm照射,不易产生臭氧,因此本研究中N-NO的去除机理可能主要是光致消去,即高能量的辐射使N-NO基团中的N-N键发生电子跃迁,共价键断裂,形成仲胺和亚硝酸根,进而达到去除N-NO的目的。此外,紫外照射下可能产生水合电子,对N-NO共价键断裂也起到了促进作用[10]。紫外照射法具有操作简便、对设备要求不高、对产品其它指标无影响等优点,易于生产放大。紫外照射法还适用于亚硝酸裂解法生产的其它低分子肝素(如达肝素钠)中N-NO的去除。

3 结论

分别采用氧化法、加热法、微波照射法、紫外照射法处理那屈肝素钙粗品,发现氧化法、加热法、微波照射法去除N-NO效果不明显(去除50%左右),而紫外照射20～60 min可以有效去除95%以上的N-NO,使那屈肝素钙产品符合EP要求(N-NO含量≤0.25 μg·g-1)。长时间紫外照射对产品其它关键指标如分子量与分子量分布、效价无影响。方法学验证结果表明,热能分析仪适用于那屈肝素钙中N-NO含量的检测。