红柳黄酮提取工艺优化及其抗氧化、抑菌活性初探

李金芳,陈婷玉,付金环,范可欣,高祎婷

(新疆第二医学院,新疆 克拉玛依 834000)

红柳(TamarixchinensisLour)又名柽柳、西河柳等,为柽柳科柽柳属植物的干燥细嫩枝叶,夏季花未开时采摘,阴干后入药[1-2]。《本草纲目》中记载其“消痞,解酒毒,利小便”,《本经逢原》记载其“去风,煎汤浴风疹身痒效”,《本草备要》记载其“治痧疹不出,喘嗽闷乱”;另外,《东医宝鉴》和《现代实用中药》中也有相关记载。一些中亚国家自古以来也将红柳用作民间医药[3]。现代研究表明,红柳含有黄酮类、萜类、有机酸类、酯类、挥发油类等成分[4],具有抗炎、抗氧化、抗菌、镇痛、抗肿瘤、保肝等多种生理活性[5-11]。

目前,红柳黄酮的提取方法主要有溶剂提取法、溶剂快速提取法、超声提取法、微波提取法、超临界提取法、仿生提取法等[12-13]。其中溶剂提取法操作简单,较为常用,但存在提取率较低、提取时间较长、溶剂消耗量较大等缺点[14-15]。鉴于此,作者以红柳黄酮得率为评价指标,先通过单因素实验确定3因素3水平,再利用响应面法优化红柳黄酮的提取工艺,通过测定红柳不同部位黄酮提取物对DPPH自由基的清除率评价其抗氧化活性,并考察其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抑菌活性,拟为红柳药用价值的开发提供依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

红柳,采自新疆克拉玛依。

无水乙醇(批号20230106)、乙酸乙酯(批号20221028),天津鑫铂特化工有限公司;石油醚(批号2022128),天津富宇精细化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(批号P1646784)、维生素C(批号20220320)、芦丁(批号1009H022),上海源叶生物科技有限公司;营养琼脂(批号20230106),上海博微生物科技有限公司;氢氧化钠颗粒(批号20161220),天津北联精细化学品开发有限公司;硝酸铝(批号20161010)、亚硝酸钠(批号20151109),天津盛奥化学试剂有限公司。

DK-98-Ⅱ型水浴锅、SPX-250BⅢ型生化培养箱,天津泰斯特仪器有限公司;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;YP202N型电子天平,上海菁海仪器有限公司;YXQ-50A型压力蒸汽灭菌锅,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司;ZHJH-C1112B型智诚超净工作台,上海智诚分析仪器制造有限公司;分析天平,梅特勒-托利多科技(中国)有限公司;旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;可见分光光度计,上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2 标准曲线的绘制

准确移取芦丁对照溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL,分别置于25 mL容量瓶中,加入5%亚硝酸钠溶液1 mL,摇匀,静置6 min;加入10%硝酸铝溶液1 mL,摇匀,静置6 min;加入4%氢氧化钠溶液10 mL,用蒸馏水定容至刻度,静置20 min后,测定510 nm处吸光度。以芦丁对照溶液浓度(c,mg·mL-1)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线(图1),拟合得线性回归方程:A=10.471c+0.004,R2=0.9969。

图1 芦丁的标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.3 红柳黄酮得率的测定

取干燥的红柳药材,用粉碎机粉碎后,过40目金属筛。称取红柳粉末,置于250 mL圆底烧瓶中,按一定料液比加入一定体积分数的乙醇,在一定温度下提取一定时间;趁热抽滤,旋蒸去除滤液中的乙醇,加入重蒸水、等量的石油醚,用分液漏斗萃取,弃去石油醚层;将水层用20 mL乙酸乙酯萃取2次后,合并乙酸乙酯层,旋蒸至干,用70%乙醇定容至100 mL;吸取2 mL,按1.2方法测定510 nm处吸光度,依据标准曲线方程计算提取液中黄酮质量。按式(1)计算红柳黄酮得率:

(1)

1.4 红柳黄酮的鉴别

盐酸-镁粉反应:在样品溶液中加入少量镁粉,再滴加1～2滴浓盐酸,在沸水浴中加热3 min,观察溶液颜色变化。

Molish反应:取样品溶液2 mL于试管中,滴加10%的α-萘酚2滴,振摇,沿试管壁滴加浓硫酸2 mL,观察溶液界面颜色变化。

AlCl3反应:取样品溶液点在滤纸上,滴加1%AlCl3乙醇溶液,晾干,观察样品斑点在可见光下及紫外光下的颜色。

聚酰胺层析:将红柳茎、叶、花及全草提取液和芦丁对照品分别点样于聚酰胺薄层板上,饱和5～10 min后展开,展开剂为乙醇-水(体积比7∶3),喷以1%的AlCl3乙醇溶液,紫外灯下观察。

1.5 红柳黄酮提取工艺优化

1.5.1 单因素实验

采用单因素实验,分别考察提取温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,g∶mL,下同)、乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)、提取时间(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h)对红柳黄酮得率的影响。

1.5.2 响应面实验

在单因素实验的基础上,选取对黄酮得率影响较大的3个因素:提取温度(A)、乙醇体积分数(B)和提取时间(C),各取高(1)、中(0)、低(-1)3个水平,根据Box-Behnken中心组合设计进行响应面实验,使用Design Expert 13.0.1.0软件分析实验数据,进一步优化红柳黄酮的提取工艺。

1.6 红柳黄酮提取物的抗氧化活性评价

1.6.1 样品溶液的制备

红柳不同部位样品溶液的制备:分别取红柳的茎、叶、花及全草黄酮提取液适量,将其浓度调至2.00 mg·mL-1;再用蒸馏水依次稀释至浓度分别为0.04 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1、0.12 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1的样品溶液。

VC样品溶液的制备:精密称取200.0 mg VC粉末,置于100 mL容量瓶中,用蒸馏水溶解并定容至刻度,摇匀,得2.00 mg·mL-1的VC样品溶液;再用蒸馏水依次稀释至浓度分别为0.04 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1、0.12 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1的样品溶液。

1.6.2 DPPH自由基清除能力的测定

精确称取6.5 mg DPPH粉末置于100 mL棕色容量瓶中,加适量无水乙醇溶解并定容至刻度,即得DPPH自由基溶液,4 ℃保存,备用。

精密移取不同浓度的样品溶液各3.00 mL置于10 mL试管中,加入DPPH自由基溶液3.00 mL,混匀,暗处放置30 min,用紫外可见分光光度计测定517 nm处吸光度(A1);以3.00 mL无水乙醇代替DPPH自由基溶液,同法操作,测定其吸光度(A2);以3.00 mL无水乙醇代替样品溶液,同法操作,测定其吸光度(A0)。按式(2)计算DPPH自由基清除率:

(2)

1.7 红柳黄酮提取物的抑菌活性评价

1.7.1 培养基、菌悬液和样品溶液的制备

培养基的制备:取营养琼脂33 g,置于1 000 mL蒸馏水中,加热至完全溶解,121 ℃高压灭菌15 min,取出冷却,将培养基倒入培养皿中,待其冷却凝固,备用。

菌悬液的制备:分别取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌菌液各0.1 mL,加生理盐水100 mL,稀释成1 000倍菌悬液,备用。

样品溶液的制备:取红柳茎、叶、花及全草黄酮提取物干燥浸膏粉末各10 mg,溶于1 mL提取溶剂中,备用。

1.7.2 抑菌实验

使用无菌移液枪分别吸取200 μL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌菌悬液,分别置于3个装有培养基的培养皿中,用灭菌涂布棒均匀涂布,将每个培养皿划分为5部分,均放置无菌的6 mm滤纸圆片;吸取红柳茎、叶、花及全草黄酮提取液各20 μL,滴加至滤纸圆片上,并滴加20 μL生理盐水作为空白对照,倒置于培养箱中,37 ℃培养24 h后取出,用十字交叉法测量抑菌圈直径,重复操作3次,结果取平均值。

2 结果与讨论

2.1 红柳黄酮的定性鉴别

通过盐酸-镁粉反应、Molish反应、AlCl3反应和聚酰胺层析对红柳提取物进行定性鉴别(表1)。结果表明红柳提取物中含黄酮类化合物。

表1 定性鉴别结果Tab.1 Results of qualitative identification

2.2 单因素实验结果

2.2.1 提取温度对黄酮得率的影响(图2)

图2 提取温度对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of flavonoids

从图2可以看出,随着提取温度的升高,红柳黄酮得率缓慢上升,当提取温度为80 ℃时,黄酮得率达到最高;继续升高提取温度,黄酮得率先缓慢下降而后急剧下降,当升至100 ℃时,黄酮得率下降尤为明显。这可能是由于,高温下,黄酮类成分分解,导致黄酮得率下降。因此,选择80 ℃作为响应面实验提取温度的中心点。

2.2.2 料液比对黄酮得率的影响(图3)

图3 料液比对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on yield of flavonoids

从图3可以看出,随着料液比的减小,即提取溶剂用量的增加,红柳黄酮得率缓慢上升,当料液比为1∶20时,黄酮得率达到最高;继续增加提取溶剂用量,黄酮得率逐渐下降。这可能是由于,提取溶剂过多,其它成分溶出量增多,导致黄酮得率下降。考虑到料液比对红柳黄酮得率的影响较小,后续响应面实验中选择料液比为1∶20。

2.2.3 乙醇体积分数对黄酮得率的影响(图4)

图4 乙醇体积分数对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on yield of flavonoids

从图4可以看出,随着乙醇体积分数的增加,红柳黄酮得率逐渐升高,当乙醇体积分数为70%时,黄酮得率达到最高;继续增加乙醇体积分数,黄酮得率迅速下降。这可能是由于,乙醇体积分数过大时,醇溶性杂质的溶出量增加,导致黄酮得率降低。因此,选择70%作为响应面实验乙醇体积分数的中心点。

2.2.4 提取时间对黄酮得率的影响(图5)

图5 提取时间对黄酮得率的影响Fig.5 Effect of extraction time on yield of flavonoids

从图5可以看出,随着提取时间的延长,红柳黄酮得率缓慢上升,当提取时间为2.0 h时,黄酮得率达到最高;继续延长提取时间,黄酮得率下降。这可能是由于,在一定温度下,提取时间过长,黄酮类化合物结构被破坏,导致黄酮得率下降。因此,选择2.0 h作为响应面实验提取时间的中心点。

2.3 响应面实验结果

2.3.1 响应面实验设计及结果

响应面实验的因素与水平见表2,实验设计及结果见表3。

表2 响应面实验的因素与水平Tab.2 Factors and levels of response surface methodologies

表3 响应面实验设计及结果Tab.3 Design and results of response surface methodologies

2.3.2 模型的建立及分析

对表3数据进行多元回归拟合,得到二次多项式回归方程:Y=4.888-0.155A+0.185B+0.5525C-0.5375AB+0.3675AC+0.1425BC-1.17025A2-1.10025B2-0.73525C2。

回归模型的方差分析见表4。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

从表4可以看出,模型的P值<0.0001,说明模型极显著;失拟项的P值>0.05,说明不显著。模型的R2为0.978 1,表明该模型可靠。

2.3.3 响应面分析

各因素交互作用对红柳黄酮得率影响的响应面图及等高线图见图6。

图6 各因素交互作用对红柳黄酮得率影响的响应面图及等高线图Fig.6 Response surface plots and contour plots for effect of interaction between various factors on yield of flavonoids from Tamarix chinensis Lour

通过响应曲面坡度的陡峭程度,可以确定两因素交互作用对响应值的影响程度,坡度越陡峭说明交互作用越明显。从图6可以看出,等高线形状均为椭圆形,响应曲面均为开口向下的抛物面,其中提取温度与乙醇体积分数、提取温度与提取时间的交互作用对红柳黄酮得率的影响表现为比较陡峭的曲面,表明提取温度与乙醇体积分数、提取温度与提取时间的交互作用对黄酮得率的影响显著,与方差分析结果一致。

2.3.4 最佳工艺验证

通过响应面法优化,得到红柳黄酮的最佳提取工艺为:提取温度79.666 ℃、乙醇体积分数71.162%、提取时间2.189 h,考虑到实际可操作性,将最佳提取工艺修正为:提取温度79.7 ℃、乙醇体积分数71.0%、提取时间2.19 h,在此条件下进行3次平行实验,黄酮得率分别为5.29 mg·g-1、5.13 mg·g-1、5.31 mg·g-1,平均得率为5.24 mg·g-1,与预测值(5.01 mg·g-1)相差在5%以内,证实了预测值与实际值的良好相关性。

2.4 抗氧化实验结果(图7)

图7 红柳黄酮提取物对DPPH自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of DPPH free radicals by flavonoid extracts from Tamarix chinensis Lour

从图7可以看出,随着浓度的增加,红柳不同部位黄酮提取物对DPPH自由基的清除率逐渐升高,但均低于VC;当浓度为0.20 mg·mL-1时,红柳茎、叶、花、全草黄酮提取物对DPPH自由基的清除率分别为90.32%、93.06%、92.42%、91.74%。

2.5 抑菌实验结果(表5)

表5 抑菌实验结果Tab.5 Results of antibacterial experiments

由表5可知,红柳不同部位黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均有一定的抑菌活性。其中,对金黄色葡萄球菌的抑菌活性强弱顺序为:茎>全草>叶>花;对大肠杆菌的抑菌活性强弱顺序为:花>全草>茎>叶;对白色念珠菌的抑菌活性强弱顺序为:茎>叶>全草>花。这可能是由于,红柳粗提物中含有多种其它成分,导致对不同菌株的抑菌活性不同。

3 结论

以红柳黄酮得率为评价指标,通过单因素实验和响应面法优化得到红柳黄酮的最佳提取工艺为:提取温度79.7 ℃、乙醇体积分数71.0%、提取时间2.19 h,在此条件下,红柳黄酮得率为5.24 mg·g-1。红柳不同部位黄酮提取物对DPPH自由基均有较强的清除能力,当浓度为0.20 mg·mL-1时,对DPPH自由基清除率顺序为:叶>花>全草>茎;红柳不同部位黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌均有一定的抑菌活性。该研究为红柳药用价值的开发提供了新思路。