耐盐反硝化细菌的筛选鉴定及生长促进剂对其反硝化性能的影响研究

姚 娜,张 磊,田凤蓉,王开春,卢 静,王淑军*

(1.江苏海洋大学 江苏省海洋生物资源与环境重点实验室,江苏 连云港 225005;2.中蓝连海设计研究院有限公司,江苏 连云港 222004)

近年来,随着工业的快速发展,工业废水排放量与日俱增,带来的氨氮污染问题愈发严重[1-2]。高浓度的氨氮废水排放会对生态环境和人类健康造成严重威胁[3]。氨氮废水的处理方法主要有物理法、化学法和生物法等[4],其中生物法应用最广泛[5]。但石油、海产品加工等行业产生的大量废水属高盐废水(溶解性固体含量大于3.5%[6]),对废水处理系统中微生物的代谢具有抑制作用,会降低微生物的脱氮能力,而陆地反硝化微生物难以在高盐环境下有效脱氮[7]。因此,从海洋环境中筛选耐盐好氧反硝化微生物,可以提高高盐废水脱氮处理效率和工艺运行的稳定性。

生长促进剂可以调控微生物的生长和代谢[8-9],环境友好、无残留的生长促进剂被广泛用于促进植物生长[10-12]。生长促进剂还可以调控微生物的代谢途径[13]。杨凯等[14]研究表明,吲哚乙酸对杜氏盐藻生长和脂肪酸合成具有促进作用;Liu等[15]研究发现,添加生长促进剂萘乙酸对普通小球藻生长和油脂合成具有明显的促进作用;耿媛媛等[16]研究发现,在氮限制条件下添加天然生长促进剂吲哚乙酸、人工合成生长促进剂萘乙酸及二氯苯氧乙酸(2,4-D),可以提高小球藻生物量和油脂含量。

1 实验

1.1 材料与试剂

海泥样品,取自海州湾在海一方污泥;废水样品,取自中蓝连海设计研究院有限公司。

赤霉素、萘乙酸、复硝酚钠、胺鲜脂等均购于国药集团。

1.2 培养基

LB液体培养基(g·L-1):胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10%,pH值7.4。

反硝化培养基(g·L-1):(NH4)2SO40.36、乙酸钠0.64、K2HPO41.0、MgSO4·7H2O 0.3、FeSO4·7H2O 0.03、NaCl 3%,pH值7.0。

筛选培养基(g·L-1):葡萄糖25、苯酚10、NaCl 50、苯胺5、柠檬酸三钠25、酵母提取物10、蛋白胨20、牛肉浸膏20、K2HPO435、KH2PO410、(NH4)2SO425、NH4Cl 25、尿素25、NaNO325、MgSO410、CaCl210、醋酸钠0.025、甘油 25 mL·L-1、甲醇50 mL·L-1,pH值7.8～8.2。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分离纯化

取1 g海泥样品接种至NaCl浓度为10%的LB液体培养基中,加入甘油25 mL·L-1、葡萄糖250 mg·L-1、甲醇50 mL·L-1,于30 ℃、130 r·min-1振荡培养48 h,将富集培养液涂布于筛选培养基平板培养一定时间,挑取单菌落进一步纯化,保藏。

1.3.2 菌株的鉴定

1.3.2.1 菌落形态观察

对纯化菌株的菌落形态、菌体的革兰氏染色进行观察并记录结果。

1.3.2.2 菌体形貌观察

将菌株培养至对数生长期,取1 mL菌液于5 000 r·min-1离心10 min,弃上清;依次用蒸馏水洗涤3次、磷酸盐缓冲液洗涤1次,15 000 r·min-1离心5 min,弃上清,晾干30 min;加入1 mL纯水制成悬液,取10 μL涂布于盖玻片上,干燥后火焰固定。滴加0.1%戊二醛溶液固定1 h;0.5%戊二醛溶液置换固定2 h;2.5%戊二醛溶液4 ℃固定12 h,利用扫描电镜观察菌体形貌。

1.3.2.3 生理生化性质测试

参照《常见细菌系统鉴定手册》[21]中相关菌的生理生化指标测试菌株的生理生化性质。

1.3.2.4 分子生物学鉴定

提取菌株核酸,选用细菌通用引物,上游引物27F,下游引物1492R,PCR产物送上海生工测序,对16S rDNA基因序列进行比对分析。

1.3.3 菌株的反硝化性能测定

将菌株接种至NaCl浓度为3%的LB液体培养基中,30 ℃、160 r·min-1培养16 h;种子液离心取沉淀,以10%接种量转接至反硝化培养基中,于30 ℃、120 r·min-1培养,分别于0 h、12 h、24 h、48 h、72 h取样测定OD600值,并计算硝态氮和亚硝态氮的浓度。

1.3.4 生长促进剂对菌株反硝化性能的影响研究

1.3.4.1 生长促进剂种类对菌株生长和脱氮性能的影响

1.3.4.2 生长促进剂浓度对菌株生长和脱氮性能的影响

将种子液以2%接种量分别接种至含不同浓度(0.001 mg·L-1、0.01 mg·L-1、0.1 mg·L-1、1 mg·L-1)筛选生长促进剂的LB液体培养基中,以未加生长促进剂为空白对照,于30 ℃、160 r·min-1培养24 h,取样测定OD600值,考察生长促进剂浓度对菌株生长的影响。同时,将种子液(离心取沉淀)以10%接种量接种至含不同浓度(0.001 mg·L-1、0.01 mg·L-1、0.1 mg·L-1、1 mg·L-1)筛选生长促进剂的100 mL反硝化培养基中,初始氨氮浓度为50 mg·L-1,以未加生长促进剂为空白对照,于30 ℃、120 r·min-1培养24 h,取样测定OD600值,计算硝态氮和亚硝态氮的浓度,考察生长促进剂浓度对菌株脱氮性能的影响。

1.3.4.3 生长促进剂对菌株去除废水COD的影响

将种子液(离心取沉淀)以10%接种量接种至含不同生长促进剂(浓度均为1 mg·L-1)的100 mL污水中,摇床培养24 h,取样测定COD值,考察生长促进剂种类对菌株去除废水COD的影响。

1.4 分析方法

每组实验均设3个平行,采用SPSS进行数据处理。采用水杨酸分光光度法测定氨氮浓度,采用紫外分光光度法测定硝态氮浓度,采用N-(1-萘基)乙二胺分光光度法测定亚硝态氮浓度,采用重铬酸盐法测定COD值。按下式计算脱氮率(R):

式中:c0为初始氮元素浓度,mg·L-1;c1为脱氮结束后氮元素浓度,mg·L-1。

2 结果与讨论

2.1 耐盐反硝化菌的筛选与鉴定

从富集培养液中筛选出多株细菌,其中菌株LY的脱氮效果最佳,其菌落形态及扫描电镜照片(8 000×)如图1所示。

图1 菌株LY的菌落形态(a)及扫描电镜照片(b)Fig.1 Colony morphology(a) and SEM image(b) of strain LY

由图1可知,菌株LY的菌落为红色圆形,直径为2～3 mm,边缘整齐,表面光滑湿润(图1a);菌株LY呈现双球相连的特征(图1b);菌株LY革兰氏染色阴性。

菌株LY的生理生化性质测试结果见表1。

表1 菌株LY的生理生化性质Tab.1 Physiological and biochemical properties of strain LY

由表1可知,菌株LY可还原硝酸盐,可以发酵或水解葡萄糖、蔗糖、半乳糖、尿素、麦芽糖、果糖等物质;氧化酶实验、明胶液化反应等为阴性。

采用MEGA 4.0软件,通过Neighbor-Joining法构建菌株LY的系统发育树,结果如图2所示。

图2 菌株LY的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain LY

对菌株LY的16S rDNA序列进行分析,获得1 452 bp的基因片段。经GenBank数据库比对,该菌与解淀粉盐水球菌(Salinicoccusamylolyticus)的相似性为99.57%。结合菌株的形态特征和生理生化性质,鉴定该菌为Salinicoccusamylolyticus。

2.2 菌株LY的反硝化性能

反硝化细菌能够将硝酸盐还原为NO、N2O、N2[22]。菌株LY对硝态氮、亚硝态氮的去除效果如图3所示。

图3 菌株LY对硝态氮、亚硝态氮的去除效果Fig.3 Removal effect of nitrate nitrogen and nitrite nitrogen by strain LY

由图3可知,12 h时,硝态氮浓度由67.34 mg·L-1快速降至19.68 mg·L-1,脱氮率为70.78%,此时有少量亚硝态氮积累;12 h后,硝态氮浓度继续下降,但下降趋势减缓,24 h时硝态氮浓度降至17.17 mg·L-1,脱氮率为74.50%,此时有大量亚硝态氮积累;48 h时,硝态氮浓度降至13.26 mg·L-1,脱氮率为80.30%,并伴有亚硝态氮浓度下降;72 h时硝态氮浓度降至12.91 mg·L-1,脱氮率为80.83%。

2.3 不同生长促进剂对菌株LY生长和脱氮性能的影响(图4)

由图4a可知,萘乙酸、胺鲜脂可以促进菌株LY的生长,而赤霉素、复硝酚钠对菌株LY的生长略微抑制。由图4b可知,与对照组相比,加入生长促进剂萘乙酸、胺鲜脂后,菌株LY的硝态氮含量显著降低,其中加入萘乙酸后的脱氮率提高了57.8%,胺鲜脂次之;而赤霉素与复硝酚钠对菌株LY脱氮几乎没有促进作用。因此,后续实验以萘乙酸作为生长促进剂,进一步考察其浓度对菌株生长和脱氮性能的影响。

2.4 萘乙酸浓度对菌株生长和脱氮性能的影响(图5)

图5 萘乙酸浓度对菌株LY生长(a)和脱氮性能(b)的影响Fig.5 Effect of naphthalene acetic acid concentration on growth(a) and denitrification performance(b) of strain LY

由图5a可知,随着萘乙酸浓度的增加,其对菌株LY生长的促进作用增强,当萘乙酸浓度为0.01 mg·L-1时,促进作用最强;继续增加萘乙酸浓度,促进作用趋于稳定。与苯甲酸对铜绿假单胞菌的生长具有低浓度促进、高浓度抑制的特征相比,萘乙酸对菌株生长的促进作用明显更强[23]。由图5b可知,当萘乙酸浓度为0.01 mg·L-1时,菌株LY可以完全转化硝酸盐;当萘乙酸浓度为0.1 mg·L-1时亦可以促进菌株LY转化硝酸盐;但当萘乙酸浓度继续增至1 mg·L-1时,不能促进菌株LY转化硝酸盐。

2.5 生长促进剂对菌株去除废水COD的影响(图6)

图6 生长促进剂对菌株LY去除废水COD的影响Fig.6 Effect of growth promoters on removing COD of wastewater by strain LY

由图6可知,4种生长促进剂均可促进菌株LY对废水COD的去除,其中萘乙酸的促进作用最强,COD值为84.7 mg·L-1,与对照组(112.0 mg·L-1)相比,废水COD去除率提升了24%;胺鲜脂的促进作用次之,COD值为91.3 mg·L-1,COD去除率提升了18%;赤霉素和复硝酚钠对菌株LY去除废水COD的促进作用较弱。

3 结论

从海州湾的海泥样品中分离得到1株耐盐反硝化细菌LY,通过形态表征、生理生化性质测试及16S rDNA基因序列分析,鉴定其为解淀粉盐水球菌(Salinicoccusamylolyticus)。菌株LY表现出良好的反硝化性能,70 h脱氮率为80.83%。萘乙酸、胺鲜脂对菌株LY的生长具有促进作用,赤霉素、复硝酚钠对菌株LY的生长略微抑制,其中萘乙酸能够显著提高脱氮效率,脱氮率提高了57.8%;添加0.01 mg·L-1萘乙酸后,菌株LY可以24 h内将硝酸盐完全转化。添加1 mg·L-1萘乙酸后,菌株LY对废水COD的去除率显著提高。该研究为菌株LY和生长促进剂萘乙酸在高盐高氮污水处理中的应用提供了依据。