链霉菌FJS31-2外分泌物的挖掘及活性分析

李钰宇,郭雨悦,王雪梅,王卓灵,苏夏雨,刘冰欣,韩继明*,杨 梦,岳昌武*

(1.巴中市中医院,四川 巴中 636000;2.延安大学基础医学院,陕西 延安 716000;3.成都医学院基础医学院,四川 成都 610500)

滥用抗生素导致耐药菌感染成为人类第3大死亡原因,也给后抗生素时代新抗生素开发带来极大挑战[1]。现阶段抗生素的开发需要在全新的策略指引下,综合运用基础医学、生命科学、组合生物化学、化学生物学以及各种现代组学技术有目的地开发重点菌株,才能有效提高新抗生素发现效率,避免低水平重复发现[2]。链霉菌(Streptomycessp.)FJS31-2是从贵州梵净山土壤中分离的一株具有极大新型活性产物挖掘潜力的菌株,在该菌株中已先后发现了Zunyimycin A～C系列抗生素[3-4]、米尔贝霉素系列衍生物[5]、UK-78623[6]等多种活性产物。基因组分析表明, 链霉菌FJS31-2基因组中包含7类共计约23个次级代谢产物合成基因簇,其中3个萜类基因簇、3个铁离子载体类基因簇、2个Ⅱ型聚酮类基因簇、4个NRPS类基因簇、7个Ⅰ型聚酮类基因簇、3个羊毛硫抗菌肽类基因簇、1个ectoine基因簇,具有很大的挖掘潜力[7]。

作者通过培养基优化[8]、核糖体工程[9]对链霉菌FJS31-2外分泌物产生条件进行优化,对其主要活性产物的成分进行初步分析,并对其抗肝癌细胞MHCC97H活性进行分析,以期为链霉菌活性产物的开发提供物质基础和技术积累。

1 实验

1.1 菌株与试剂

链霉菌(Streptomycessp.)FJS31-2,从贵州梵净山20 cm深地表土壤中分离得到,保存于中国普通菌种保存中心(菌保号:CGMCC 4.7321)。

萃取用试剂乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、甲醇等均为分析纯,成都科龙公司;抗生素,北京索莱宝公司;实验用标准品,西格玛-奥德里奇(上海)贸易有限公司;色谱用试剂,德国默克(Merck)集团;培养基,碧迪医疗器械(上海)有限公司。

1.2 外分泌物产生条件优化

1.2.1 培养基优化

在确定培养基种类后,通过调整碳源、氮源的组成和比例设计7种发酵培养基(表1),分别在培养7 d、14 d后观察菌落形态、颜色及外分泌物积累情况,采用高效液相色谱法测定外分泌物产量,以确定链霉菌FJS31-2产生外分泌物的最优培养基。

表1 7种发酵培养基组成/(g·L-1)Tab.1 Components of 7 fermentation media/(g·L-1)

1.2.2 核糖体工程

核糖体工程激活活性产物生物合成。根据预实验考察链霉菌FJS31-2对不同抗生素(链霉素、卡那霉素、利福平、庆大霉素,终浓度分别为5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1)的耐受量,最后选择链霉素制备抗生素平板。在确定的最优培养基中加入不同浓度(2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1)的链霉素,以优化出可筛选出核糖体突变的亚致死量的最合适的链霉素浓度,划线接种链霉菌FJS31-2,28 ℃静置培养,挑取在亚致死量抗生素平板上存活的单菌落(可能是核糖体突变的菌落),继续在含合适浓度抗生素的培养基平板上划线培养,继代3代后大规模接种,28 ℃静置培养,分别在培养4 d、10 d时观察菌落生长及外分泌物产生情况。每个浓度做3个平行。

1.3 外分泌物发酵及纯化

待菌落发酵后,在固体培养基中加入等量乙酸乙酯,抽提3次,旋蒸后得到固体浸膏,加入甲醇或丙酮并与硅胶粉混匀,使溶剂挥发呈细沙状。湿法装柱,二氯甲烷-丙酮(体积比10∶1)洗脱。外分泌物过Sephadex LHS20(MeOH)柱(内径2.5 cm,长75 cm),甲醇洗脱。RP-HPLC(XBridge BEH C18 Prep column,130 Å,10 mm×250 mm,5 μm)纯化,在纯度达到98%时,旋蒸,甲醇重溶。通过MS(Thermo-Finnigan LCQ DECA XP)和NMR(Bruker AV 600 MHz)对外分泌物进行分析。

1.4 外分泌物抗肝癌细胞MHCC97H活性分析

收集链霉菌FJS31-2外分泌物,于冷冻干燥机中冻干,称重,将冻干物溶于超纯水中配制成2 mg·mL-1的母液,备用。然后将肝癌细胞MHCC97H以1×104个/孔接种于96孔板中,待细胞长至80%融合度时,分别加入终浓度为32 μg·mL-1和50 μg·mL-1的外分泌物,并以50 μg·mL-1的顺铂(cisplatin)为阳性对照,分别于6 h、12 h、18 h、48 h、72 h、91 h测定细胞活性,考察培养时间对外分泌物抗肝癌细胞MHCC97H活性的影响,确定最适的培养时间。

将肝癌细胞MHCC97H以1×104个/孔接种于96孔板中,待细胞长至80%融合度时加入外分泌物,使终浓度分别为400 μg·mL-1、200 μg·mL-1、100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1,在培养72 h时中止培养,用显微镜观察肝癌细胞MHCC97H形态及数量并拍照,采用磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法检测细胞活性。

2 结果与讨论

2.1 培养基对外分泌物的影响

链霉菌FJS31-2在7种培养基中分别培养7 d、14 d后的菌落形态、颜色及外分泌物积累情况如图1所示。

图1 不同培养基对链霉菌FJS31-2外分泌物的影响Fig.1 Effect of different media on extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2

由图1可知,培养7 d,6#、7#培养基上的菌落颜色较1#～5#培养基上的明显变黄(培养皿中黑点表示黄色或黄褐色菌落),同时菌落上开始有少量淡黄色外分泌物出现;培养14 d,6#、7#培养基上的菌落颜色变成明显的黄褐色,同时菌落上开始有大量的黄褐色外分泌物出现,而2#～5#培养基上的菌落颜色没有明显变化,同时也未见外分泌物产生,1#培养基上的菌落开始部分变黄,同时有少量淡黄色外分泌物出现。表明,6#、7#培养基可促进链霉菌FJS31-2外分泌物的产生。

2.2 链霉素对外分泌物的影响

选择7#培养基,分别添加2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1链霉素,分别培养4 d、10 d,考察链霉素对链霉菌FJS31-2外分泌物的影响,结果如图2所示。

图2 不同浓度链霉素对链霉菌FJS31-2外分泌物的影响Fig.2 Effect of different concentrations of Streptomycin on extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2

由图2可知,在不同浓度链霉素的胁迫下,链霉菌FJS31-2外分泌物的生成情况不一样;在2 μg·mL-1链霉素的胁迫下,链霉菌FJS31-2菌落数量最多,且培养4 d就开始有少量的淡黄色外分泌物出现,培养10 d有大量的黄褐色外分泌物出现。表明,2 μg·mL-1链霉素胁迫可促进链霉菌FJS31-2外分泌物的产生。

2.3 外分泌物的主要成分

将收集的链霉菌FJS31-2外分泌物用乙酸乙酯萃取,进行高分辨质谱(HRMS)分析(图3),发现链霉菌FJS31-2外分泌物主要活性产物含有4种结构类似物,初步推断其谱学特征符合四环萜类化合物,分子式为C28H40O2。

图3 链霉菌FJS31-2外分泌物主要活性产物的HRMS图谱Fig.3 HRMS spectrum of main active products in extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2

2.4 外分泌物的抗肝癌细胞MHCC97H活性

将链霉菌FJS31-2外分泌物与肝癌细胞MHCC97H共培养不同时间后,测定细胞活性,结果如图4所示。

图4 培养时间对外分泌物抗肝癌细胞MHCC97H活性的影响Fig.4 Effect of culture time on inhibition activity of extracellular secretion to hepatoma cell line MHCC97H

由图4可知,外分泌物对肝癌细胞MHCC97H的抑制率随着培养时间的延长逐渐升高,72 h后继续延长培养时间,抑制率变化不大。因此,后续实验在培养72 h后中止培养。

将链霉菌FJS31-2外分泌物与肝癌细胞MHCC97H共培养,外分泌物终浓度分别为400 μg·mL-1、200 μg·mL-1、100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1,培养72 h后中止培养,其显微镜照片如图5所示,链霉菌FJS31-2外分泌物对肝癌细胞MHCC97H的抑制率如图6所示。

图5 链霉菌FJS31-2外分泌物与肝癌细胞MHCC97H共培养72 h后的显微镜照片Fig.5 Microscopic photos of extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2 co-cultured with hepatoma cell line MHCC97H for 72 h

由图5、6可知,不同浓度的链霉菌FJS31-2外分泌物均能抑制肝癌细胞MHCC97H的生长,且大致呈浓度依赖性,200 μg·mL-1外分泌物对肝癌细胞MHCC97H的抑制率达到了84%(图6)。

2.5 讨论

通过培养基优化、核糖体工程对潜力菌株链霉菌FJS31-2的外分泌物进行了挖掘,尽管在其中发现了可能是新型结构的分子式为C28H40O2的四环萜类化合物,但由于产物产量较低、化合物结构较复杂,其结构的确定尚未完成;该化合物生物合成激活机制也有待进一步阐明;化合物虽然表现出抗肝癌细胞MHCC97H活性,但其它生物活性和作用机制尚需进一步研究。

3 结论

利用培养基优化、核糖体工程对链霉菌FJS31-2外分泌物进行了挖掘,并通过HRMS技术初步获得了分子式为C28H40O2的四环萜类化合物,该化合物可抑制肝癌细胞MHCC97H的生长,并呈浓度依赖性。为从链霉菌FJS31-2中获取新型抗生素奠定了基础。