阿司匹林抗血小板相关基因多态性在汉族NSTEMI 患者人群中的分布

李六水，王 飞，周 澳，杨 青，刘宪军

（1.首都医科大学附属北京潞河医院，北京 101149；2.上海市金山区中西医结合医院，上海 201501；3.北京市朝阳区东坝第二社区卫生服务中心，北京 100015）

非ST 段抬高型心肌梗死（non-ST-segment elevation myocardial infarction，NSTEMI）是由于冠状动脉内不稳定的粥样硬化斑块糜烂、破裂所致的一种急性冠脉综合征，常伴有不同程度的局部血栓形成、血管痉挛导致血管闭塞，以急性心肌缺血、坏死为主要特征，以突发胸痛且长时间无法缓解为主要临床症状。与ST 段抬高型心肌梗死相比，NSTEMI 更常见于老年人及女性，且合并症更多［1］。NSTEMI 的辅助检查中，血清心肌坏死标记物常明显升高，心电图检查常提示急性心肌缺血性改变，但不伴ST 段抬高改变。NSTEMI 具有病情进展迅速、致死率极高、预后极差等特点。从发病机制上，NSTEMI 发生时，不稳定的粥样硬化斑块糜烂、破裂可激活机体的自身保护机制，导致大量血小板黏附、聚集，局部血栓形成，冠状动脉管腔发生完全或不完全闭塞，导致急性心肌缺血缺氧、坏死。从治疗上，国内外指南指出［2-5］，及早、充分、持久的抗血小板治疗对NSTEMI 的疾病进展及预后具有重要意义。阿司匹林是NSTEMI 抗血小板治疗过程中的代表药物之一，但部分患者在使用阿司匹林后无法发挥其正常的抗血小板药理作用，正常用法用量下仍发生心脑血管事件，即产生阿司匹林抵抗。

随着药物基因组学的发展，现已证实，GPⅢa PLA2、PEAR1和PTGS1等基因［6］的遗传多态性是导致AR 或阿司匹林抗血小板作用个体差异的重要因素，因此，根据个体的遗传多态性实现个体化治疗，具有重要的临床意义和经济意义。目前，尚无关于GPⅢa PLA2、PEAR1和PTGS1基因多态性位点在汉族NSTEMI 患者人群中分布规律的系统报道。本研究以汉族NSTEMI 患者人群为研究对象，对与阿司匹林抗血小板药理作用相关的GPⅢa PLA2、PEAR1和PTGS1基因中3 个重要的多态性位点进行检测分析并研究其分布特征，为阿司匹林在不同基因型的NSTEMI 患者中的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究采用横断面研究，选取2016 年01 月～2022 年12 月于首都医科大学附属北京潞河医院住院诊治的汉族NSTEMI 患者107 例，其中男性80例，女性27 例；年龄（32～91）岁，平均年龄（65±14）岁。所有受试者都对上述基因多态性位点检测知情同意，本研究经首都医科大学附属北京潞河医院医学伦理委员会批准（伦理批号：2023-LHKY-023-01）。

1.1.1 纳入标准 （1）年龄≥18 周岁，有独立行为能力；（2）性别不限；（3）汉族；（4）符合《不稳定性心绞痛和非ST 段抬高心肌梗死诊断与治疗指南》［7］中NSTEMI 的 诊 断 标 准；（5）已 完 成GP Ⅲa PLA2（rs5918） 、PEAR1（rs12041331） 和PTGS1（rs10306114） 3 个基因多态性位点检测；（6）临床病历资料完整。

1.1.2 排除标准 （1）年龄＜18 周岁；（2）非汉族；（3）不符合上述NSTEMI 的诊断标准，或仅疑似NSTEMI 但未确诊；（4）未全部完成GPⅢa PLA2（rs5918） 、PEAR1（rs12041331） 和PTGS1（rs10306114） 3 个基因多态性位点检测，如仅完成其中的1～2 个位点检测；（5）临床病历资料不完整。

1.2 试剂

核酸纯化试剂、基因位点测序反应通用试剂管等，均购自北京华夏时代基因科技发展有限公司。

1.3 仪器

TL998A 荧光检测仪（分子诊断仪），西安天隆生物科技有限公司生产；TD4A 台式低速离心机，长沙英泰仪器有限公司生产。

1.4 基因多态性位点检测

基因多态性位点采用荧光染色原位杂交的方法进行测定。基本检测原理是：根据碱基互补配对原则，将已知单链核酸（荧光素标记）作为探针，与待测样本中未知的单链核酸进行特异性结合，形成杂交的双链核酸（可被检测）。在反应体系中，共进行50 个升温/降温循环，升温时双链被打开，降温时探针与未知的单链核酸结合，进行原位杂交，配对成功则发出荧光。由于DNA 分子沿染色体纵轴线性排列，故探针可直接与染色体杂交，从而在染色体上定位特定基因。具体检测方法为：每位患者用一次性真空抗凝采血管（EDTA 抗凝）采集静脉血标本2～3 mL，轻摇采血管，使血样与采血管中的抗凝剂充分混匀；取150 μL 血样，加入1 mL 红细胞裂解液，混匀后静置；3 000 r/min 离心10 min，弃上清；加入50 μL 核酸纯化试剂并混匀；分别取1.5 μL 混悬液至相应的基因位点测序反应通用试剂管中，充分混匀；置于TL998A 荧光检测仪（分子诊断仪）中的相应位置；打开计算机中安装的微测序程序，设定相应的运行参数，检测GPⅢa PLA2（rs5918）、PEAR1（rs12041331）和PTGS1（rs10306114） 3 个基因多态性位点的基因型。

1.5 Hardy-Weinberg（H-W）平衡吻合度检验

计算本研究中所选取的汉族NSTEMI 患者人群中PEAR1 （rs12041331）位点上各基因型的理论频数，与本研究中观察到的该位点上各基因型的实际频数进行Hardy-Weinberg（H-W）平衡吻合度检验［8］，判断本研究所选取的样本群体中该位点上各基因型的分布是否达到了遗传平衡，从而判断所选取的样本群体对汉族NSTEMI 患者人群是否具有良好的群体代表性。

1.6 基因型频率与等位基因频率计算

采用频数计数法统计本研究中所选取的汉族NSTEMI 患 者 人 群 中GP Ⅲa PLA2（rs5918）、PEAR1（rs12041331）和PTGS1（rs10306114） 3 个基因多态性位点的基因型频率，如突变型杂合子的基因型频率为突变型杂合子的个体数目占样本总人数的百分比，即突变型杂合子基因型频率=突变型杂合子个体数目/样本总人数×100%。根据基因型频率推算等位基因频率，如某基因多态性位点上只存在等位基因A 和B，则A 等位基因的频率P（A）=（AA 型纯合子基因型个体数目×2+AB 型杂合子基因型个体数目×1）/（样本总人数×2）×100%；同理可计算B 等位基因的频率P（B），或者P（B）=100%-P（A）。然后，对推算得到的等位基因频率与1000 Genomes 数据库中收录的其他部分人群中相应等位基因频率之间的分布差异性进行比较。

1.7 统计学处理

采用SPSS 20.0 软件对本研究中的数据进行统计分析。计数资料以例数（百分比）表示，不同人群之间相同位点的基因型频率和等位基因频率的分布差异性比较采用χ2检验，若有超过1/4 的单元格的理论频数均＜5，则使用Fisher 精确概率法。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H-W 平衡吻合度检验结果

由于本研究中GP Ⅲa PLA2（rs5918）位点上CC 型个体的实际频数为0，PTGS1（rs10306114）位点上AG 型和GG 型个体的实际频数也均为0（见后述），故基于PEAR1（rs12041331）位点的基因型频数进行H-W 平衡吻合度检验。对本研究中107 例汉族NSTEMI 患者PEAR1 （rs12041331）位点的基因型检测结果进行Hardy-Weinberg（H-W）平衡吻合度检验，发现该位点上各基因型（GG、GA 和AA）的实际频数与理论频数分布之间并无统计学差异（χ2=0.02，P=0.99＞0.05），说明本研究中选取的样本群体对汉族NSTEMI 患者人群具有良好的代表性，见表1。

表1 PEAR1 （rs12041331）基因型Hardy-Weinberg（H-W）平衡吻合度检验结果Tab 1 Results of Hardy-Weinberg（H-W） genetic balance test for PEAR1 （rs12041331） genotype

2.2 各多态性位点上的基因型频数与基因型频率

本研究中，107 例汉族NSTEMI 患者的GPⅢa PLA2（rs5918）、PEAR1（rs12041331）和PTGS1（rs10306114） 3 个基因多态性位点上的基因型频数与 基 因 型 频 率，见 表2。 其 中，GP Ⅲa PLA2（rs5918）位点上最常见的基因型是野生型纯合子（TT），占97%左右，突变型杂合子（TC）较少，所占比例不足3%，无突变型纯合子（CC）；PEAR1（rs12041331）位点上突变型杂合子（GA）所占比例最多，接近45%，野生型纯合子（GG）所占比例次之，为42%左右，而突变型纯合子（AA）所占比例最少，为13%左右；PTGS1（rs10306114）位点上全部为野生型纯合子（AA），即所占比例为100%，未见突变型杂合子（AG）或纯合子（GG）。

表2 各多态性位点上的基因型频数与基因型频率［n（%）］Tab 2 Genotype count and frequency at each polymorphic locus ［n（%）］

2.3 各多态性位点上的等位基因频率

本研究中，107 例汉族NSTEMI 患者的GPⅢa PLA2（rs5918）、PEAR1（rs12041331）和PTGS1（rs10306114） 3 个基因多态性位点上的等位基因频率，见表3。GPⅢa PLA2（rs5918）位点上，T 等位基因频率接近99%，C 等位基因频率仅为1%左右；PEAR1（rs12041331）位点上，G、A 等位基因频率分别为64%和36%左右；PTGS1（rs10306114）位点上，无G 等位基因，A 等位基因频率为100%。

表3 各多态性位点上的等位基因频率（%）Tab 3 Allele frequency at each polymorphic locus （%）

2.4 1000 Genomes 数据库中收录的其他部分人群中的相应等位基因频率

至于其他部分种族人群中GP Ⅲa PLA2（rs5918） 、PEAR1（rs12041331） 和PTGS1（rs10306114） 3 个基因多态性位点上的等位基因频率，从1000 Genomes 数据库中进行检索，并进行归纳和总结，见表4。本研究共选取了3 个东亚人群即北京汉族（CHB）、西双版纳傣族（CDX）和日本东京（JPT）、1 个欧洲人群即、1 个欧洲人群即西班牙伊比利亚人群（IBS）、1 个南亚人群即巴基斯坦拉合尔旁遮普人群（PJL）、1 个非洲人群即美国西南部的非洲裔美国人群（ASW）和1 个南美洲人群即秘鲁利马人群（PEL）。在所调查的不同种族人群中，GPⅢa PLA2 （rs5918）位点上T 等位基因频率均超过85%，如在西双版纳傣族人群中高达100%，在北京汉族和日本东京人群中均超过99%，在非洲裔美国人群及秘鲁利马人群中也均超过90%；PEAR1（rs12041331）位点上G 等位基因频率在不同种族人群中变异度相对较大，如在西双版纳傣族、日本东京及非洲裔美国人群中为53%～57%，而在西班牙伊比利亚人群中超过85%；不同种族的人群中，PTGS1 （rs10306114）位点上A 等位基因频率普遍较高，如在巴基斯坦拉合尔旁遮普人群和秘鲁利马人群中均接近100%，而在北京汉族、西双版纳傣族以及日本东京人群中均为100%。

表4 1000 Genomes 数据库中收录的其他部分人群中相应等位基因频率（%）Tab 4 Some other populations’ related allele frequencies retrieved from 1000 Genomes databases （%）

2.5 汉族NSTEMI 患者人群与部分其他人群中相应等位基因的分布差异性比较

本研究中107 例汉族NSTEMI 患者中GPⅢa PLA2（rs5918）、PEAR1（rs12041331）和PTGS1（rs10306114） 3 个基因多态性位点上各等位基因的分布情况，与1000 Genomes 数据库中收录的部分其他人群中相应等位基因分布之间差异性的比较结果，见表5。汉族NSTEMI 患者人群中，GP Ⅲa PLA2（rs5918）位点上，T 等位基因频率（98.60%）与北京汉族（99.03%）、西双版纳傣族（100.00%）和日本东京（99.04%）人群相比无统计学差异（均P＞0.05），但高于秘鲁利马人群（94.71%）（P＜0.05），也显著高于西班牙伊比利亚人群（86.45%）、巴基斯坦拉合尔旁遮普人群（86.98%）及非洲裔美国人群（91.80%）（均P＜0.01）；汉族NSTEMI 患者人群PEAR1（rs12041331）位 点 上，G 等 位 基 因 频 率（64.49%）与 北 京 汉 族（60.19%）、日 本 东 京（56.25%）、巴基斯坦拉合尔旁遮普（70.83%）及非洲裔美国人群（56.56%）和秘鲁利马人群（70.00%）相比均无统计学差异（均P＞0.05），但高于西双版纳傣族人群（53.23%）（P＜0.05），又显著低于西班牙伊比利亚人群（85.51%）（P＜0.01）；汉族NSTEMI 患者人群中PTGS1（rs10306114）位点上，A、G等位基因频率分别为100.00%、0%，北京汉族、西双版纳傣族及日本东京人群与之相同，但A 等位基因频率均显著高于西班牙伊比利亚人群（93.93%）和非洲裔美国人群（86.89%）（均P＜0.01），与巴基斯坦拉合尔旁遮普人群（98.96%）及秘鲁利马人群（97.65%）相比并无统计学差异（均P＞0.05）。

表5 汉族NSTEMI 患者人群与部分其他人群中相应等位基因的分布差异性比较（χ2值）Tab 5 Comparison of the distribution differences of related alleles between the Han population of NSTEMI patients and some other populations（χ2 value）

3 讨论

本研究选取107 例汉族NSTEMI 患者组成样本群体，经H-W 平衡吻合度检验证实为一个具有良好代表性的样本群体，对该样本群体中与阿司匹林抗血小板药理作用相关的GPⅢa PLA2、PEAR1和PTGS1基因中3 个重要的多态性位点的基因型及等位基因的分布特征进行了系统分析。

血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa 受体活化是导致血小板聚集、冠状动脉血栓形成及心肌缺血的最终共同途径［9］。GP Ⅱb/Ⅲa 受体又称整合素αIIbβ3，其中GP Ⅲa 亚基的编码基因具有高度多态性，最常见的等位基因亚型是PLA1（T）和PLA2（C）。据报道，PLA2（C）等位基因携带者发生心肌梗死或不稳定性心绞痛的风险显著升高［10］。本研究所调查的107 例 汉 族NSTEMI 患 者 中，GP Ⅲa PLA2（rs5918）位点上以野生型纯合子（TT 型）为主，占97.20%，突变型杂合子（TC 型）仅占2.80%，突变型纯合子（CC 型）缺如。该结果与徐建东等［11］的报道结果类似，在其研究中，接受阿司匹林肠溶片治疗的83 例住院患者中，PLA1/PLA1（TT）型为80 例（96.39%），PLA1/PLA2（TC）型为3 例（3.61%），PLA2/PLA2（CC）型缺如，与本研究相比，各基因型的分布无统计学差异（χ2=0.01，P=0.92＞0.05）。相应地，107 例汉族NSTEMI 患者中，GPⅢa PLA2（rs5918）位点上的等位基因以T 为主，占98.60%，等位基因C 仅占1.40%，该位点上的等位基因分布与北京汉族、西双版纳傣族和日本东京3 个东亚人群类似；但T 等位基因频率高于南美洲的秘鲁利马人群，也显著高于欧洲的西班牙伊比利亚人群、南亚的巴基斯坦拉合尔旁遮普人群和非洲裔美国人群，可能与种族或地域等因素有关。

血小板内皮聚集受体1（PEAR1）属于酪氨酸激酶受体家族的成员，参与血小板之间相互作用所引发 的 接 触 诱 导 活 化［12，13］。PEAR1基 因 主 要 位 于 人染色体1q23.1，其单核苷酸多态性与某些疾病的发生以及抗血小板药理效应的个体差异密切相关［14］，如PEAR1（rs12041331） GG 型对阿司匹林应答良好，GA 型应答次之，而AA 型存在AR，故AA 型应答最差且影响患者预后［15］。本研究中，汉族NSTEMI 患者人群中PEAR1（rs12041331）位点上突变多见，野生型纯合子（GG 型）、突变型杂合子（GA 型）和突变型纯合子（AA 型）分别占42%、45%和13%左右；王黎阳等［16］报道的183 例急性心肌梗死患者中，3 种 基 因 型 分 别 为55 例（30.05%）、91 例（49.73%）和37 例（20.22%），与本研究相比，2 组人群中该基因型的分布也无统计学差异（χ2=5.11，P=0.08＞0.05），但其检测的基因多态性位点并非PEAR1基因上的rs12041331 位点，而是该基因上的rs2768759 位点，由此可见PEAR1基因上有多个位点的基因多态性可能都与心肌梗死易感性存在关联。 本研究中，汉族NSTEMI 患者人群中PEAR1（rs12041331）位点上G、A 等位基因频率分别为64%和36%左右，与石秀锦等［17］报道的缺血性疾病患者中相应等位基因频率（62.32% 和37.68%）也并无统计学差异（χ2=0.24，P=0.62＞0.05），此外，汉族NSTEMI 患者人群中该位点上等位基因的分布也与北京汉族、日本东京以及非洲裔美国人群和秘鲁利马人群等多数人群并无差异。可见，PEAR1（rs12041331）位点的基因型或等位基因的分布差异可能与某些疾病（如NSTEMI 与缺血性疾病）之间并无相关性，也与上述种族差异之间并无相关性。

前列腺素内过氧化物合酶1（PTGS1）又称环氧化酶1（COX-1），是阿司匹林抗血小板药理作用的主要靶点。由于COX-1 是由PTGS1基因编码的，故PTGS1基因多态性会影响COX-1 的活性，进而影响血小板聚集效应及阿司匹林抗血小板药理作用，即PTGS1基因多态性与AR 的发生具有一定的相关性［18］。据报道，PTGS1 GG 型患者发生AR 的概率是AG/AA 基因型患者的16.495 倍（95%CI：4.076 - 66.754），因此PTGS1 GG 型是发生AR 的危险因素之一［19］。本研究所调查的不同种族人群中，PTGS1（rs10306114）位点上A 等位基因频率普遍较高，均超过86%，且在北京汉族、西双版纳傣族以及日本东京人群中均为100%，在巴基斯坦拉合尔旁遮普人群和秘鲁利马人群中也接近100%。汉族NSTEMI 患者人群中PTGS1（rs10306114）位点上100%为AA 型，AG 或GG 型缺如；该人群中A 等位基因频率也为100%，与肖飞等［20］报道的71 例使用阿司匹林的汉族患者人群类似。陈莉等［21］报道的1 175 例使用阿司匹林的患者中，PTGS1（rs10306114）位点上仅1 例（0.09%）为AG 型，其余1 174 例（99.91%）均为AA 型，能检测出AG 型可能是由于其调查的样本量更大，也可能是由于其调查的样本人群中包括了非汉族患者（其对患者种族未进行描述）。

总之，本研究对汉族NSTEMI 患者人群中与阿司匹林抗血小板相关的GP Ⅲa PLA2（rs5918）、PEAR1（rs12041331）和PTGS1（rs10306114） 3 个重要位点的基因型及等位基因的分布特征进行了调查研究，发现汉族NSTEMI 患者人群中GPⅢa PLA2（rs5918）和PTGS1（rs10306114）位点上均以野生型纯合子为主，突变极少，而PEAR1（rs12041331）位点上突变常见，以突变型杂合子所占比例最多。对于NSTEMI 患者或存在发生NSTEMI 高风险的患者，建议在有条件时应及时进行相关位点的基因检测，从而便于必要时根据基因型结果进行抗血小板的个体化治疗。

作者贡献度说明：

李六水：负责试验设计、样本检测、数据处理及论文撰写；刘宪军：负责论文修改及试验指导；王飞、周澳及杨青：负责论文修改及校对。

所有作者声明不存在利益冲突关系。