葛根异黄酮抑制XOD 和GLUT9 分别发挥减少尿酸生成、促进尿酸排泄双重途径的机制

李 桐，梁宝月，刘 晗，方少婷，张茗杰，罗 婧，陈品诺，宋纪池，初 晓，黄春霞

（长沙医学院，湖南 长沙 410219）

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是嘌呤代谢长期紊乱而诱发、导致以尿酸持续增高、沉积而引发的炎症疾病，患者典型表现为急性或慢性关节炎、关节畸形，甚者出现关节破坏或合并发生尿酸性肾脏疾病，严重影响患者生活质量［1］。除此之外，HUA 疾病还是诸多心血管疾病的独立危险因素，可影响患者生存期。据相关流调数据显示，我国内地地区居民中高尿酸血症患病率约为13.3%，截止2022 年数据模型估计的HUA 患者累积超过8 000万，持续加强该疾病机制及临床干预研究意义重大［2，3］。既有相关研究已证实，葛根异黄酮基于抗氧化、抗炎症、调代谢的作用机制，能有效缓解HUA基础病情，但其作用机制尚不明确［4，5］。同时前期研究初步发现，XOD 是影响嘌呤代谢途径的关键酶，通过抑制其活性能减少尿酸生成，而GLUT9 是参与尿酸排泄的转运蛋白，通过该渠道也可以促进尿酸排泄［6，7］。此外，有相关学者进行的动物实验发现，经葛根异黄酮干预的HUA 动物模型其血液和尿液中尿酸检出含量均有明显降低，提示葛根异黄酮在降低尿酸生成、促进尿酸排泄方式发挥了积极作用［8］。综合上述两点背景及线索，笔者猜测：葛根异黄酮发挥HUA 干预作用途径可能与影响XOD和GLUT9 表达，继而发挥减少尿酸生成、促进尿酸排泄双重途径有关，基于该点假设，特进行了如下对照实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2021 年8 月～2022 年4 月 期 间，对40 只2 月 龄SPF 级昆明小鼠（长沙医学院动物实验中心提供，动物许可证SCXK 湘2021-110133）进行临床实验研究。均为雄性，初始体质量区间30～50 g、平均（36.18±4.29） g，分4 笼饲养（研究期间因意外或非实验因素导致小鼠死亡通过自动填补补充样本数量），室内日夜温度维持在（25.00±3.00） ℃，适应性饲养7 d 后开始实验。本研究获长沙医学院医学伦理委员会批准（批准编号：CY 伦20220603）。

1.2 葛根异黄酮的提取和纯化

葛根原材料购至陕西康盛堂药业有限公司（产品批号：20140506），其粉碎、脱脂、提取、纯化、配置过程如下。（1）粉碎：蒸馏水反复冲洗葛根，60 ℃烘干至恒重，粉碎过筛待用。（2）脱脂：用石油醚继续进行脱脂处理，同时用乙醇（70%）加热回流提取并过滤。（3）提取：用乙醇浸泡葛根后进行漉液提取，将滤液浓缩成稠膏状，真空干燥后得到干浸膏。（4）纯化：采用大孔吸附树脂串联柱配合乙醇洗脱机进行纯化（工作液流速28 V/h，浸提浓缩液酸碱度为5）。（5）配置：使用前以纯化后稠膏状的葛根异黄酮为溶质，以羧甲基纤维素钠（浓度0.5%）溶液为溶剂，配置溶液，现配现用［6，9］。

1.3 主要仪器

UMT2 型电子分析天平（奥豪斯公司，美国）；TG-16W 型高速离心机（长沙湘锐离心机有限公司，中国）；DW-YL270 型超低温冰箱（无锡冠亚恒温制冷技术有限公司，中国）；BK-400 型全自动生化分析仪（济南好来宝医疗器材有限公司，中国）；DHG-9030A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，中国）；JJ-12J 型脱水机（武汉俊杰电子有限公司，中国）；RM2016 型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，中国）；DS-U3 型正置光学显微镜成像系统（尼康公司，日本）。

1.4 分组干预

将入组小鼠随机均分为各组（健康组、模型组、低、中、高剂量组），每组8 只小鼠。各组灌胃物质浓度均为1 mL/10 g 体质量，灌胃频率1 次/d，造模和干预方法如下。

1.4.1 造模方法 模型组和低中高剂量组均来源于成功造模的HUA 小鼠，基于研究主旨为评价尿酸生成和重吸收，特擦用次黄嘌呤造模方式，具体方法如下：按体重剂量（100 mg/kg）单次经腹腔注射次黄嘌呤，同时使用乙胺丁醇（250 mg/kg）予以灌胃，1 次/d，连续21 d［10］。0.5 h 后小鼠血清尿酸值达到峰值，6.0 h 后血清尿酸值将至一半，但仍高于诊断标准（血清尿酸值≥200 μmol/L）［11］。

1.4.2 干预方法 （1）健康组（不予造模和干预）：健康小鼠每天灌胃羧甲基纤维素钠（0.5%），剂量250 mg/kg 标准，1 次/d。（2）模型组（HUA 小鼠不予干预）：HUA 小鼠每天灌胃羧甲基纤维素钠（0.5%），剂量250 mg/kg 标准，1 次/d。（3）低剂量组（HUA 小鼠）：HUA 小鼠每天灌胃葛根异黄酮，剂量125 mg/kg 标准，1 次/d。（4）中剂量组（HUA 小鼠）：HUA 小鼠每天灌胃葛根异黄酮，剂量250 mg/kg 标准，1 次/d。（5）高剂量组（HUA 小鼠）：HUA 小鼠每天灌胃葛根异黄酮，剂量500 mg/kg 标准，1次/d。

1.5 效应指标收集

（1）干预前和干预后（30 d）分次采血经静置（1 h）、低温离心（4 ℃离心10 min）参照试剂盒定量检测血清中尿酸（Uric acid，SUA）、尿素氮（Urea nitrogen，BUN）、肌酐（Creatinine，SCr）含量。（2）干预前和干预后（30 d）分次采集新鲜尿液经离心（3 000 r/min）、去除沉渣参照试剂盒定量检测上清液中尿酸（SUA）、尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）含量。（3）干预后（30 d）处死小鼠并解剖取肾脏组织，Western blot 法定量检测肾脏组织中黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）和人葡萄糖转运蛋白9（Human glucose transporter 9，GLUT9）含量，酶联免疫法定量检测肾脏组织中环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF-a）、白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1β）含量。

1.6 统计学处理

采用SPSS22.0 软件记录数据并统计分析，五组计量资料（±s）比较用F检验，两两分组之间比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组干预后肾脏炎症因子和XOD、GLUT9 含量的比较

各组干预后比较，肾脏炎症因子（COX-2、TNF-a、IL-1β）和XOD、GLUT9 含量的差异均有统计学意义（P＜0.05）。模型组肾脏炎症因子（COX-2、TNF-a、IL-1β）和XOD、GLUT9 含量均高于健康组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明单次经腹腔注射次黄嘌呤的造模方法能显著影响肾脏炎症因子和XOD、GLUT9 含量的表达。低剂量组肾脏炎症因子（COX-2、TNF-a、IL-1β）和XOD、GLUT9含量均低于模型组，说明葛根异黄酮干预对肾脏炎症控制和抑制XOD、GLUT9 表达，均有明显效果。随着剂量组干预剂量增加，肾脏炎症因子（COX-2、TNF-a、IL-1β）和XOD、GLUT9 含量逐步降低，各指标含量均有低剂量组＞中剂量组＞高剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明葛根异黄酮对肾脏炎症控制和抑制XOD、GLUT9 表达，呈现出一定剂量反应关系，随着葛根异黄酮干预剂量增加，干预效果明显增强。见表1。此外，Western blot 结果表示，与健康组比较，模型组小鼠肾组织中XOD 和GLUT9 的蛋白表达量显著升高。与模型组比较，葛根异黄酮干预组中小鼠肾组织XOD 和GLUT9 蛋白表达量均显著降低，这进一步表明小鼠发生HUA 时伴随肾脏XOD 和GLUT9 表达升高，同时葛根异黄酮可能通过下调XOD 和GLUT9的表达发挥抗HUA 作用。见图1。

图1 Western blot 检测各组小鼠肾组织中XOD 和GLUT9的蛋白表达Fig 1 The expression of XOD and GLUT9 in renal tissue of mice in each group detected by Western blot

表1 各组干预后肾脏炎症因子和XOD、GLUT9 含量的比较（n=8，±s）Tab 1 Comparison of renal inflammatory factors， XOD and GLUT9 levels in five groups of mice after intervention（n=8，±s）

表1 各组干预后肾脏炎症因子和XOD、GLUT9 含量的比较（n=8，±s）Tab 1 Comparison of renal inflammatory factors， XOD and GLUT9 levels in five groups of mice after intervention（n=8，±s）

注：t1（P1）表示模型组和健康组比较；t2（P2）表示低剂量组和模型组比较；t3（P3）表示中剂量组和低剂量组比较；t4（P4）表示高剂量组和中剂量组比较。

GLUT9（Normalized）分组COX-2（pg/mg）TNF-a（pg/mg）IL-1β（pg/mg）XOD（U/g）0.14±0.02 0.67±0.04 0.48±0.03 0.39±0.04 0.28±0.05 230.114（0.000）34.696（0.000）11.125（0.000）5.269（0.000）5.029（0.000）健康组模型组低剂量组中剂量组高剂量组F（P）t1（P1）t2（P2）t3（P1）t4（P4）105.52±12.52 206.79±13.33 176.94±11.11 157.40±12.05 128.42±13.71 79.946（0.000）16.212（0.000）5.036（0.000）3.490（0.003）4.648（0.000）120.42±13.33 337.41±12.06 276.60±14.76 203.75±18.51 173.40±16.18 255.924（0.000）35.340（0.000）9.340（0.000）9.009（0.000）3.614（0.002）1 115.30±57.42 1 975.44±43.23 1 570.67±66.66 1 425.50±70.35 1 306.79±56.64 236.201（0.000）35.036（0.000）14.915（0.000）4.385（0.000）3.848（0.001）21.25±2.27 30.06±1.99 28.83±1.02 25.94±1.80 23.14±1.67 41.100（0.000）10.242（0.000）2.412（0.029）4.089（0.000）3.384（0.004）

2.2 各组干预前和干预后血液中SUA、BUN、SCr含量的比较

干预前或干预后比较，各组血液3 项指标（SUA、BUN、SCr）含量的差异均有统计学意义（P＜0.05）。具体看来：干预前模型组血液3 项指标含量均高于健康组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明造模成功；其他各组两两组别之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。干预后模型组血液3 项指标含量均高于健康组，低、中、高剂量组血液3 项指标含量均低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05），随着剂量组干预剂量增加，小鼠血液3 项指标含量逐步降低，3 项指标含量均有低剂量组＞中剂量组＞高剂量组。说明葛根异黄酮对血液中SUA、BUN、SCr 生成均有抑制作用，呈现出一定剂量反应关系，随着葛根异黄酮干预剂量增加，干预效果明显增强。干预后相比干预前，3 项指标含量均有下降，组内比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组干预前和干预后血液中SUA、BUN、SCr 含量的比较（n=8，±s）Tab 2 Comparison of SUA， BUN and SCr contents in blood of five groups of mice before and after intervention（n=8，±s）

表2 各组干预前和干预后血液中SUA、BUN、SCr 含量的比较（n=8，±s）Tab 2 Comparison of SUA， BUN and SCr contents in blood of five groups of mice before and after intervention（n=8，±s）

注：t1（P1）表示模型组和健康组比较；t2（P2）表示低剂量组和模型组比较；t3（P3）表示中剂量组和低剂量组比较；t4（P4）表示高剂量组和中剂量组比较；干预后相比干预前，*P＜0.05。

分组健康组模型组低剂量组中剂量组高剂量组F（P）t1（P1）t2（P2）t3（P1）t4（P4）SUA（μmol/L）干预前237.11±14.52 378.40±17.77 382.11±22.23 379.79±17.64 384.05±23.50 88.113（0.000）18.025（0.000）0.381（0.708）0.239（0.814）0.424（0.677）干预后238.12±15.63 378.05±19.40 321.01±14.63*294.52±12.74*260.53±11.31*106.125（0.000）16.444（0.000）6.872（0.000）3.997（0.001）5.841（0.000）BUN（mmol/L）干预前10.73±2.51 15.70±2.23 15.88±2.11 15.69±2.09 15.72±2.30 7.943（0.000）4.333（0.000）0.171（0.866）0.187（0.853）0.028（0.977）干预后10.80±2.66 15.75±2.04 14.02±0.47*13.31±0.55*12.16±0.42*11.352（0.000）4.323（0.000）2.419（0.047）2.540（0.031）3.551（0.002）SCr（μmol/L）干预前31.60±3.64 38.11±4.20 38.15±3.73 38.22±3.58 38.40±3.83 4.856（0.003）3.429（0.003）0.020（0.983）0.039（0.968）0.100（0.921）干预后30.88±4.32 38.06±1.77 36.13±1.51*34.42±1.66*32.87±1.01*11.164（0.000）4.502（0.000）2.428（0.028）2.230（0.041）2.335（0.033）

2.3 各组干预前和干预后尿液中SUA、BUN、SCr含量的比较

干预前或干预后比较，各组尿液3 项指标（SUA、BUN、SCr）含量的差异均有统计学意义（P＜0.05）。具体看来：干预前模型组尿液3 项指标含量均高于健康组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明造模成功；其他各组两两组别之间差异均无统计学意义（P＞0.05）。干预后模型组尿液3 项指标含量均高于健康组，低、中、高剂量组小鼠尿液3 项指标含量均低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05），随着剂量组干预剂量增加，小鼠尿液3 项指标含量逐步降低，3 项指标含量均有低剂量组＞中剂量组＞高剂量组。说明葛根异黄酮对尿液中SUA、BUN、SCr生成均有抑制作用，呈现出一定剂量反应关系，随着葛根异黄酮干预剂量增加，干预效果明显增强。干预后相比干预前，3 项指标含量均有下降，组内比较的差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组干预前和干预后尿液中SUA、BUN、SCr 含量的比较（n=8，±s）Tab 3 Comparison of SUA， BUN and SCr contents in urine of five groups of mice before and after intervention（n=8，±s）

表3 各组干预前和干预后尿液中SUA、BUN、SCr 含量的比较（n=8，±s）Tab 3 Comparison of SUA， BUN and SCr contents in urine of five groups of mice before and after intervention（n=8，±s）

注：t1（P1）表示模型组和健康组比较；t2（P2）表示低剂量组和模型组比较；t3（P3）表示中剂量组和低剂量组比较；t4（P4）表示高剂量组和中剂量组比较；干预后相比干预前，*P＜0.05。

分组健康组模型组低剂量组中剂量组高剂量组F（P）t1（P1）t2（P2）t3（P1）t4（P4）SUA（mmol/L）干预前1.89±0.37 3.60±0.43 3.66±0.33 3.63±0.41 3.64±0.38 32.708（0.000）8.825（0.000）0.324（0.750）0.116（0.908）0.052（0.958）干预后1.90±0.47 3.62±0.15 3.41±0.13*2.88±0.50*2.17±0.30*37.609（0.000）10.206（0.000）3.097（0.007）3.003（0.008）3.564（0.002）BUN（mmol/L）干预前543.76±65.52 1 523.30±66.08 1 561.42±64.33 1 563.70±59.79 1 570.52±76.51 368.488（0.000）30.817（0.000）1.210（0.244）0.076（0.940）0.205（0.839）干预后1 546.81±71.06 1 556.98±47.77 1 329.28±54.03*1 117.88±59.99*724.73±42.08*308.477（0.000）0.347（0.732）9.243（0.000）7.666（0.000）15.707（0.000）SCr（mmol/L）干预前2.19±0.20 5.34±0.43 5.40±0.42 5.36±0.45 5.39±0.47 98.277（0.000）19.446（0.000）0.292（0.774）0.190（0.851）0.134（0.894）干预后2.31±0.60 5.38±0.46 4.72±0.41*4.20±0.39*3.18±0.49*52.853（0.000）11.888（0.000）3.135（0.006）2.690（0.016）4.768（0.000）

3 讨论

近十年随着我国居民饮食、生活方式的改变，HUA 疾病发病率缓慢持续增高，甚至已成为众多居民生活中习以为常的常见病症［12］。HUA 持续存在会引发多器官（肾脏、胰腺、肝脏等）功能损害，药物治疗虽能控制病情，但对彻底扭转病情依然存在一定难度，因此在常规药物层面之外探寻新型活性物质、治疗方法对改善病症或预后意义深远［13］。葛根作为传统药食同源物资，具有升举阳气、发散表邪功效，诸多方剂中被推荐用于改善HUA 疾病的症状，部分学者猜测葛根发挥作用的机制可能与其富含的黄酮类物质、葛根素、葛根苷等活性成分有关［14］。本研究特以葛根含量最多的异黄酮为研究重点，分析其对HUA 模型小鼠的具体影响，并分析可能机制。

本研究发现，干预后的模型组其COX-2、TNFa、IL-1β 含量均高于健康组。由于模型组和健康组均未使用药物予以特殊干预，仅存在造模差别，因此可知次黄嘌呤造模方式对小鼠肾脏造成了典型损伤，客观表现为局部组织炎症反应。干预后相比干预前，各剂量组小鼠血液和尿液中SUA、BUN、SCr 含量均有显著降低，说明葛根异黄酮能积极修复HUA 模型小鼠的受损病灶，发挥减少尿酸生成的同时，加快尿酸排泄，从而减少尿酸在其体内蓄积或沉淀。组间比较则发现，无论血液或尿液SUA、BUN、SCr 含量，均有低剂量组＞中剂量组＞高剂量组的特征，客观证实：随着葛根异黄酮使用剂量增加，其对减少尿酸生成、促进尿酸排泄的双重作用机制对应有所增强，呈现出一定剂量反应关系，但具体相关程度如何尚不得知，后续研究需结合其他统计学方法加以验证。

本研究还发现，HUA 模型小鼠肾脏组织中XOD 和GLUT9 的活性和蛋白表达量均明显高于健康组。哺乳动物体内影响尿酸生成主要涉及两条关于尿酸的内源性合成途径，即腺嘌呤核苷酸脱去氨基转化为肌酐和鸟嘌呤核苷酸形成鸟苷，上述过程均主要在肝脏内部完成［15］。XOD 则是影响该过程的关键酶和限速酶，肾脏组织中XOD 含量的显著升高说明次黄嘌呤造模干预过程相应引发了内源性核酸分解代谢障碍［16，17］。进一步组间比较则发现，低、中、高HUA 小鼠其肾脏组织中XOD 和GLUT9 活性和蛋白表达量均低于模型组，一方面证实XOD 和GLUT9 参与了HUA 病情转归过程，另一方面说明葛根异黄酮干预HUA 小鼠能影响体内XOD 和GLUT9 相关通路。因此，我们进一步猜测XOD 和GLUT9 分别发挥减少尿酸生成、促进尿酸排泄的可能机制主要与如下几点原因有关：第一，XOD 直接通过影响原发病灶炎症状态而影响脏器基础功能，尤其是影响肝脏代谢功能，经葛根异黄酮干预后的HUA 小鼠其肝脏代偿能力有所恢复，因嘌呤代谢障碍而积蓄的尿酸会相应减少［7，18］；第二，高容量、低亲和力的尿酸转运体GLUT9 含量和功能相应有减少和抑制，因此肾小管上皮细胞内通过基质膜转运入血管的尿酸有所减少［19，20］。

综上，葛根异黄酮能通过抑制XOD、GLUT9 表达，继而发挥减少HUA 小鼠尿酸生成、促进尿酸排泄作用，同时有利于缓解疾病的炎症程度。该研究创新之处在于，初步明确葛根异黄酮干预HUA 疾病的有效性，探索了葛根异黄酮发挥作用的两条主要机制。但是该研究亦有一定不足，效应指标主要通过检测了XOD、GLUT9 蛋白表达含量，尚未结合基因检测深入探究，后续研究有待进一步完善。

所有作者声明不存在利益冲突关系。