和厚朴酚调控SIRT3 抑制慢性缺氧诱导的小胶质细胞极化

张 淼，高兴红，胡 源

（1.武汉大学中南医院神经内科，湖北 武汉 430071；2.遵义医科大学基础医学院，贵州 遵义 5630062；3.武汉大学中南医院神经心理科，湖北 武汉 430071）

慢性脑低灌注是阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD）和血管性认知障碍共同的病理生理基础［1］。一项对1 171 名不同阶段AD 患者的脑成像、血液、脑脊液等标志物随访研究发现，脑低灌注在AD 中发生早于其关键病理标志物-淀粉样蛋白的沉积，且脑血流量的下降与疾病的进展相关［2］。另一方面，颈动脉粥样硬化所致血管狭窄可能通过慢性脑低灌注引起血管性认知障碍［3］。在颈动脉狭窄患者中，通过手术进行血管再通，恢复脑血流量可延缓血管性认知功能损害的进程［4］。本课题组及其他研究组发现，慢性脑低灌注能够诱导中枢神经系统炎性细胞-小胶质细胞及星形胶质细胞的激活［5，6］。但目前慢性脑低灌注中神经炎症的发生机制尚不完全清楚，对此进行动物及细胞研究有助于相关痴呆类疾病的防治。

厚朴是一种传统中药，取自木兰科植物的树叶。《神农本草经》描述厚朴：味苦，温。主治中风、伤寒、头痛、寒热、惊悸、气血痹。多年来被中医用于治疗脑梗死及偏头痛等病症。和厚朴酚（Honokiol，HNK）是厚朴的主要活性成分之一，为一种小分子苯丙酸类脂溶性化合物，容易透过血脑屏障，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤的作用［7］。研究发现，HNK 可以激活内源性的压力感应和抗氧化酶SIRT3，改善与手术有关的认知和神经系统的损伤［8］。前期研究发现，HNK 能够改善慢性脑低灌注大鼠认知损害和神经损伤［9］，在本实验中，进一步构建离体慢性缺氧模型，观察HNK 对于慢性缺氧小胶质细胞炎症通路和极化的影响，为痴呆防治提供新的药物选择和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HNK（MCE，HY-N0003）、氯化钴（CoCl2，国药集团，10007216）、3-TYP（MCE， HY-108331）、小鼠小胶质细胞细胞系BV2 购于普诺赛生命科技有限公司（Procell Life Science&Technology Co.，Ltd.），酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）根 据 试 剂 盒 购 买 自Elabscience，Trizol 试剂 （Invitrogen， CA， US No.15596026），逆转 录 试 剂 盒（Vazyme Biotech Co，Nanjing，China No.Q311-02）。去 乙 酰 化 酶3（SIRT3）、NLRP3、Caspase1 和Tubulin 一抗、相应二抗均购买自Abcam 公司。

1.2 细胞培养、处理和观察

BV2 完全培养基的组成：DMEM 高糖+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素，37 ℃，5%CO2条件下培养；在缺氧条件和浓度筛选实验中，氯化钴以不 同 浓 度（0 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）加入培养基中诱导缺氧，和厚朴 酚 分 别 以 不 同 浓 度（3 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）加入培养基中。此后BV2 细胞分为4 组：正常组、氯化钴组（模型组，氯化钴浓度100 μmol/L）、慢性缺氧+HNK（浓度为10 μmol/L）、慢性缺氧+HNK+3-TYP 组（参考既往文献［10］，浓度为5 μmol/L）。其中HNK 与3-TYP 均与氯化钴同时加入，处理48 h。

1.3 ELISA 检测炎症因子水平

将各个试剂提前20 min 拿出复温，将标准品按梯度稀释后，与稀释好的样本依次加入预先包被抗体的酶标条中，孵育1.5 h，随后加入生物素化抗体孵育1 h，每孔洗涤3 遍后加入生物素化工作液37 ℃孵育30 h，依次洗涤5 遍后加入TMB 孵育10 min，加入终止液后立即于37 ℃预热好的酶标仪下以450 nm 波长检测吸光度（OD 值）。

1.4 RT-PCR

吸去细胞培养上清后，DPBS 洗涤细胞3 遍，随后加入Trizol。加入氯仿12 000 r 15 min 4 ℃离心后小心吸取中间水相层，加入等体积异丙醇混匀后静置10 min。 预先以DEPC 水配置75%乙醇，在12 000 r 10 min 4 ℃条件下离心后弃去上清后加入75%乙醇，再次7 500 r 15 min 4 ℃离心。弃去上清并小心吸去残留乙醇，加入适量DEPC 水后55 ℃10 min 促溶解，Nanodrop 测定浓度。逆转录条件：42 ℃ 2 min 去除基因组DNA， 50 ℃ 15 min ，85 ℃ 5 s，4 ℃维持后完成逆转录。SYBR Green 荧光染料试剂盒构建qPCR 体系，设立3 个复孔。qPCR 条件：预变性 95 ℃ 30 s，循环反应 95 ℃ 5 s -60 ℃（根据不同引物的 Tm 值进行调整） 30 s，循环反应 40次，溶解曲线 95 ℃ 30 s -60 ℃ 60 s -95 ℃ 15 s。引物序列见表1。

表1 各指标PCR 引物序列Tab 1 PCR primer sequences for each indicator

1.5 Western blot 检测

各组细胞离心后加入RIPA 裂解液，充分裂解后检测蛋白浓度，加入上样缓冲液后混匀，金属浴煮沸变性后上样。根据蛋白浓度于SDS-PAGE 凝胶进行上样，每孔20 μg 蛋白，设置电泳条件为75 V，30 min + 120 V，60 min，待溴酚蓝近玻璃底边时停止电泳，裁剪合适大小的PVDF 膜，200 mA 恒流转膜，根据目的蛋白分子量大小选择合适转膜时间。转膜后4 ℃冰箱内一抗孵育过夜，次日漂洗后加入相应HRP 二抗，室温孵育1 h 后ECL 显色。

1.6 ROS 测量

试剂盒采购自碧云天公司，将细胞接种并培养在96 孔板中，各组细胞用药干预结束后，弃掉细胞培养液，每孔加入适量DCFH-DA，终浓度为10 μmol/L ，37 ℃ 细胞培养箱内孵育20 min，每隔3～5 min 摇匀，使试剂与细胞充分混匀。孵育结束后，用无血清细胞培养液洗涤3 次，每次5 min，洗涤结束后使用荧光酶标仪在激发波长488 nm，发射波长525 nm 处检测荧光强度值。

1.7 统计学分析

实验结果使用Graphprism 9.5 统计软件分析，ELISA 及PCR 数据将空白组设置为1，并以此对各组进行归一化处理，数据以（±s）表示。多重比较采用单因素方差分析系，并采用Bonferroni 法进行组间比较，P＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同氯化钴慢性处理对小胶质细胞系BV2 的影响

与对照组相比，50、75、100 μmol/L 浓度氯化钴处理48 h 后BV2 细胞活性均无明显降低，200 μmol/L 氯化钴处理组细胞较对照组活性明显降低（0 μmol/Lvs.200 μmol/L，t=4.16，P＜0.05），提示过度缺氧引起细胞死亡，见图1A。与对照组相比，50、75、100 μmol/L 氯化钴处理BV2 后，上清炎症因子TNFα（t值分别为5.34、7.77、10.67，P＜0.05）及IL-1β（t值分别为5.07、5.48、11.99，P＜0.05）蛋白水平较对照明显升高，选取其中炎症因子水平最高的100 μmol/L 浓度作为后续实验浓度，见图1B、1C。

图1 慢性缺氧对BV2 细胞活性及炎症因子的影响Fig 1 Effect of chronic hypoxia on BV2 cell activity and inflammatory factors

2.2 HNK 对慢性缺氧BV2 细胞炎症因子释放的影响

使用ELISA 法检测不同浓度HNK 对100 μmol/L 氯化钴处理BV2 细胞培养液上清炎症因子水平的影响。发现5 μmol/L 和10 μmol/L 浓度HNK 可显著抑制氯化钴诱导的BV2 炎症因子TNFα（CoCl2vs.CoCl2+5 μmol/L HNK，t=7.76，CoCl2vs.CoCl2+10 μmol/L HNK，t=9.36，P＜0.05）与IL-1β（CoCl2vs.CoCl2+5 μmol/L HNK，t=4.72，CoCl2vs.CoCl2+10 μmol/L HNK，t=5.93，P＜0.05）释放，见图2，选取10 μmol/L 浓度HNK 作为后续处理的药物浓度。

图2 不同浓度和厚朴酚对慢性缺氧BV2 细胞炎症因子分泌的影响Fig 2 Effect of different concentrations and magnolol on the secretion of inflammatory factors in chronic hypoxic BV2 cells

2.3 HNK 抑制慢性缺氧条件下BV2 细胞M1 极化，该作用被3-TYP 逆转

与对照组相比，慢性缺氧组BV2 细胞M1 极化标 志 物CD86，iNOS的mRNA 水 平 和CD16/32 比值 明 显 增 加（Controlvs.CoCl2，t值 分 别 为8.36、10.64、7.54，P＜0.05），M2 标 志 物Arg-1和CD206的mRNA 水平下调（Controlvs.CoCl2，t值分别为6.16、5.22，P＜0.05），提示慢性缺氧成功诱导小胶质细胞M1 极化。与氯化钴组相比，慢性缺氧+HNK 组CD86，iNOS的mRNA 水 平 和CD16/32比值下调（CoCl2vs.CoCl2+HNK，t值分别为5.81、7.79、5.79，P＜0.05），而Arg-1和CD206的mRNA水平升高（t值分 别为4.59、7.15，P＜0.05），见图3A，提示HNK 可抑制慢性缺氧诱导的小胶质细胞M1 极化，使之向M2 极化转变；加入SIRT3 抑制剂3-TYP 后，HNK 对慢性缺氧BV2 细胞CD86、iNOS的mRNA 水平和CD16/32 比值下调（CoCl2+HNKvs.CoCl2+HNK+3-TYP，t值 分 别 为5.63、5.68、5.08，P＜0.05）、对Arg-1和CD206基因转录的上调作用（t值分别为4.58、7.59，P＜0.05），以及对炎症因 子TNFα 和IL-1β 的 释 放 抑 制 作 用（t值 分 别 为6.12、6.15，P＜0.05）均被逆转，提示HNK 调节缺氧BV2 细胞极化作用为SIRT3 依赖性见图3A、3B。

图3 和厚朴酚对慢性缺氧BV2 细胞炎症因子分泌及极化标志物的作用被3-TYP 逆转Fig 3 The effect of magnolol on the secretion of inflammatory factors and polarization markers in chronic hypoxic BV2 cells reversed by 3-TYPE

2.4 HNK 抑制慢性缺氧BV2 细胞诱导的星形胶质细胞极化，该作用被3-TYP 逆转

对照组BV2 细胞形态正常，呈类圆形；氯化钴组BV2 细胞形态发生改变，呈现梭形；与氯化钴组相比，慢性缺氧+HNK 组细胞形态趋于正常，加入3-TYP 后HNK 对慢性缺氧BV2 细胞极化形态的抑制作用减弱，细胞再次出现梭形形态，见图4A。SIRT3 为线粒体去乙酰化酶，具有抗氧自由基（ROS）形成作用，而后者与小胶质细胞激活和炎性通路密切相关。对各组细胞进行SIRT3、ROS 和炎症通路分子检测，发现与对照组相比，氯化钴组SIRT3 蛋 白 表 达 显 著 下 调（Controlvs.CoCl2，t=5.13，P＜0.05），而ROS 水 平、NLRP3 和Caspase1蛋 白 表 达 显 著 升 高（Controlvs.CoCl2，t分 别 为4.63、6.40、9.13，P＜0.05）。与氯化钴组相比，慢性缺氧+HNK 组细胞SIRT3 蛋白表达上调（CoCl2vs.CoCl2+HNK，t=5.06，P＜0.05），ROS 水 平、NLRP3 和Caspase1 蛋白表达显著下降（t值分别为4.78、5.57、6.60，P＜0.05）。SIRT3 抑 制 剂3-TYP能逆转HNK 对慢性缺氧BV2 细胞SIRT3 蛋白的上调（CoCl2+HNKvs.CoCl2+HNK+3-TYP，t=6.13，P＜0.05），以及对ROS 水平、NLRP3 和Caspase1 蛋白的下调作用（t值分别为5.00、5.25、5.78，P＜0.05），见图4B，4C。

图4 3-TYP 可逆转和厚朴酚抑制慢性缺氧诱导的星形胶质细胞毒性极化作用Fig 4 Inhibition of magnolol reversed by 3-TYPE on chronic hypoxia induced astrocyte toxicity polarization effect

3 讨论

慢性脑低灌注是AD 和血管性痴呆共同的病理基础，其可促进AD 或血管性痴呆的疾病进程，对其进行研究具有重要意义。HNK 是厚朴叶中的单体提取物，之前研究发现HNK 可改善慢性脑低灌注大鼠认知功能，减轻海马神经炎症反应［9］，本文进一步探究HNK 抗炎作用的机制。

钴可以造成细胞轻微缺氧，适合构建长时间处理的细胞模型。本实验中发现长时间（48 h）处理时，0～100 μmol/L 氯化钴并未引起小胶质细胞死亡，且剂量依赖性增加其分泌的神经炎症因子；其中100 μmol/L 氯化钴可体外诱导小胶质细胞细胞形态转为活化的分支状，且M1 型极化标志物转录增加。以上特征与其他研究报道的慢性脑低灌注动物模型中小胶质细胞生物行为类似［11］，因此通过氯化钴慢性处理，可模拟在体慢性缺氧诱导的小胶质细胞活化。

小胶质细胞是中枢神经系统中的类巨噬细胞，具有免疫防御作用。小胶质细胞激活后具有两种表型，其中M1 型释放大量炎症因子，而且可以促进星形胶质细胞活化，后者释放的毒性物质可直接引起神经损伤，进而造成脑功能损害。M2 型小胶质细胞则具有神经保护及修复作用［12］。慢性脑低灌注模型小鼠胼胝体存在小胶质细胞M1 型极化，使用免疫抑制剂芬戈莫德可促进小胶质细胞极化由M1 向M2 型转化，从而促进白质损伤修复［11］。另一项研究发现，敲除小鼠小胶质细胞特异性的电压门控氢离子通道，可降低慢性脑缺血诱导的细胞内ROS 产生，推动M1 至M2 的表型转换并改善白质损伤［13］。因此，小胶质细胞M1 型极化在慢性脑低灌注性认知损害中具有核心作用，针对其进行干预是今后的重要研究方向。

SIRT3 是一种主要表达于线粒体的抗氧化酶，可通过去乙酰化作用调控三羧酸循环和电子传递链的关键酶，实现抗氧化应激作用［14］。既往研究表明，HNK 可激活SIRT3，增加其表达，并在包括抑郁、AD、术后认知障碍等多种中枢神经系统疾病模型中均具有抑制神经炎症的作用［8，15，16］。研究也发现，HNK 可抑制慢性脑低灌注大鼠海马神经损伤和认知障碍，但具体机制尚不明确［9］。本研究发现，HNK 可上调慢性缺氧小胶质细胞SIRT3 蛋白表达，降低ROS 和M1 标志物CD86 和iNOS 的转录水平，同时上调Arg-1、CD206 等M2 标志物的转录，而使用SIRT3 抑制剂则以上作用消失。提示在慢性缺氧背景下，HNK 可通过SIRT3 促进小胶质细胞极化表型转换。既往研究发现，慢性脑缺血大鼠海马SIRT3 活性虽然下降，但总体蛋白表达无明显变化［9］，而本研究作为体外实验，发现小胶质细胞在慢性缺氧时SIRT3 表达下调，提示SIRT3 在慢性缺氧时表达调控可能具有细胞特异性。

NLRP3 小体为一种多蛋白复合物，由NLRP3蛋白、衔接蛋白ASC 和caspase1 前体蛋白组成，缺氧可影响小胶质细胞电子传递链，从而于线粒体中产生大量ROS，进而使NLRP3 蛋白形成寡聚体并激活。激活的NLRP3 与衔接蛋白相互作用，促使caspase 1 前体转化为caspase 1 效应蛋白，后者可促进多种炎症因子的释放，并可促进星形胶质细胞活化和分泌神经毒性成分［17］。本研究发现HNK 在降低细胞内ROS 的同时，可以抑制炎症小体NLRP3和下游caspase1 效应蛋白表达和M1 极化标志物，且该作用为SIRT3 依赖性，提示ROS-NLRP3-caspase 1 通路可能为慢性缺氧条件下小胶质细胞M1极化的关键通路。

作者贡献度说明：

张淼：细胞培养、Elisa、PCR 实验与写稿；高兴红：数据分析与写稿；胡源：Western Blot 实验，写稿、审稿与经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。