3种炮制方法对雷公藤肝肾毒性的减毒作用

肖丽涓，毛泽玲，黄 枚，陈亚萍，张玉琴，南丽红*

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.浙江省桐庐县中医院，浙江 桐庐 311500）

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）为卫矛科雷公藤属植物，有大毒，具有活血化瘀、祛风湿等功效，临床常用于治疗慢性肾炎、类风湿关节炎等疾病［1］，目前被认为是治疗自身免疫性疾病的首选中药［2-4］。但雷公藤及其制剂的毒副作用较大，易引起肝肾损伤，大大限制了其临床应用，故研究其减毒的方法尤为重要［5-8］。炮制是一种应用广泛的中药减毒方法，中药经过炮制后，可降低或减少其毒副作用。有文献报道雷公藤经过蒸制后可以减毒［9］，除此之外，还可以利用甘草与莱菔子对雷公藤进行炮制。甘草具有缓急止痛、清热解毒、补脾益气等功效，药物经甘草汁炮制后能降低毒性，缓和药性；莱菔子性平、味辛，无毒，可下气消食，现代药理研究表明莱菔子还具有解毒作用［10-11］。故本研究采用莱菔子炮制、甘草炮制和蒸制分别对雷公藤进行炮制，观察其对肝肾毒性的影响。

1 材 料

1.1 实验动物 50只SPF 级ICR 小鼠，体质量为（20±2）g，雌雄各半，购自于上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）20120002，于福建中医药大学实验动物中心实验室喂养。饲养条件：环境安静，自由摄食饮水，光照/暗循环12 h，温度为20～25 ℃，适应性喂养7 d 后进行实验。

1.2 实验药物 雷公藤产地为福建省三明市泰宁县，经福建中医药大学药学院杨成梓教授鉴定为卫矛科雷公藤属植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）。

1.3 主要试剂及仪器 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）、球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）及肌酐（SCR）ELISA 检测试剂盒均购自美国R＆D Systems 公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽还原酶（GR）ELISA 检测试剂盒均购自上海西塘生物科技有限公司；酶标仪（美国Bio-Rad 公司，型号：Model 680）；切片机（德国Leica 公司，型号：RM2125）。

2 方 法

2.1 雷公藤炮制方法 ① 莱菔子炮制品：加200 mL水浸没10 g 莱菔子后，煎煮2 次，每次1 h，合并2 次煎液，并浓缩至100 mL，再加入切片后的雷公藤100 g，文火煮至莱菔子煎液被吸收完全，取出，干燥。② 甘草炮制品：加200 mL 水浸没10 g 甘草后，煎煮2次，每次1 h，合并2次煎液，并浓缩至100 mL，再加入切片后的雷公藤100 g，文火煮至甘草煎液被吸收完全，取出，干燥。③ 蒸制品：将切片后的雷公藤置于蒸制容器内，蒸制4 h 后，取出，干燥。

2.2 分组及给药 将50 只ICR 小鼠按体质量随机分为正常组、生品组、莱菔子组、甘草组与蒸制组，每组各10 只。生品组、莱菔子组、甘草组与蒸制组均按20 mL/（kg·d）体质量分别灌胃2.4 g/mL 雷公藤生品、雷公藤莱菔子炮制品、雷公藤甘草炮制品及雷公藤蒸制品水煎液，正常组灌胃等剂量生理盐水。1 次/d，连续14 d。

2.3 标本采集 末次给药后，称取小鼠体质量，按体质量10 mL/kg 腹腔注射3%乌拉坦麻醉，并摘眼球取血；脱颈椎处死后剖取肝脏及双侧肾脏，生理盐水洗去血液与黏液，滤纸吸干多余水份后于分析天平上称重，记录肝脏、肾脏湿质量，并计算肝脏系数、肾脏系数；取左侧1/2 肾和5 mm×5 mm×5 mm大小的肝大叶组织置于固定液中固定24 h，进行石蜡包埋后备用；余下肝组织和肾组织放入冻存管中，并迅速投入液氮中，后转移至-80 ℃冰箱保存。

2.4 指标检测

2.4.1 小鼠肝肾功能指标检测 将全血室温静置1 h，在冷冻离心机中以4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液，严格按照ELISA 检测试剂盒说明书测定小鼠血清ALT、AST、GLB、ALB、BUN、SCR 含量。

2.4.2 小鼠肝脏系数、肾脏系数检测 根据“2.3”项下记录的小鼠体质量及肝肾组织湿质量，计算肝脏系数与肾脏系数，计算公式：

2.4.3 病理形态学观察 将肝肾组织石蜡块切片，并行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察肝肾组织病理学变化。

2.4.4 小鼠肝肾组织脂质过氧化指标检测 取“2.3”项下的肝肾组织标本，加生理盐水制成10%组织匀浆，在冷冻离心机中以4 ℃，3 000 r/min 离心15 min，取上清液，采用ELISA 法检测肝肾组织GR、SOD、MDA 含量。

2.5 统计学方法 数据采用SPSS 25.0 软件进行分析。计量资料属正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐者采用LSD-t 检验，方差不齐者采用Games-Howell 检测。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 5 组小鼠肝肾功能指标比较 与正常组比较，生品组与甘草组AST 含量均显著增多，且生品组ALT、GLB 含量均显著增多（P＜0.05），生品组与蒸制组ALB 含量均显著减少（P＜0.05）；与生品组比较，蒸制组、甘草组及莱菔子组AST、ALT、GLB 含量均显著减少（P＜0.05），甘草组及莱菔子组ALB 含量显著增多（P＜0.05）；莱菔子组、甘草组与蒸制组ALT、AST、GLB、ALB 含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 5 组小鼠肝功能指标比较（±s）

表1 5 组小鼠肝功能指标比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与生品组比较，2） P＜0.05。

ALB/（μg/mL）507.63±65.15 388.01±46.571）437.74±67.381）459.58±68.032）478.09±78.232）组别正 常 组生 品 组蒸 制 组甘 草 组莱菔子组n 10 10 10 10 10 ALT/（ng/mL）10.38±1.13 12.85±1.391）11.35±1.182）11.19±1.332）11.07±1.152）AST/（ng/mL）11.33±1.25 14.05±1.251）12.42±1.112）12.59±1.281）2）12.00±1.372）GLB/（μg/mL）152.02±21.08 199.60±27.621）163.19±23.172）168.85±23.812）160.26±21.212）

与正常组比较，生品组、蒸制组、甘草组以及莱菔子组SCR、BUN 含量均显著增多（P＜0.05）；与生品组比较，蒸制组、甘草组、莱菔子组SCR、BUN含量显著减少（P＜0.05）；莱菔子组、甘草组与蒸制组SCR、BUN 含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 5 组小鼠肾功能指标比较（±s）

表2 5 组小鼠肾功能指标比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与生品组比较，2） P＜0.05。

BUN/（mmol/L）3.394±0.538 5.200±1.1081）3.974±0.3431）2）3.916±0.3861）2）3.894±0.3391）2）组别正 常 组生 品 组蒸 制 组甘 草 组莱菔子组n 10 10 10 10 10 SCR/（μmol/L）16.534±2.103 22.167±3.5781）19.869±1.6581）2）20.220±1.3641）2）18.344±2.0721）2）

3.2 5 组小鼠肝脏系数与肾脏系数比较 与正常组比较，生品组肝脏系数明显增大（P＜0.05）；与生品组比较，蒸制组、甘草组、莱菔子组肝脏系数明显减小（P＜0.05）；与正常组比较，生品组、蒸制组、甘草组、莱菔子组的肾脏系数，差异无统计学意义（P＞0.05）；莱菔子组、甘草组与蒸制组肝脏系数与肾脏系数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 5 组小鼠肝脏系数与肾脏系数比较（±s）

表3 5 组小鼠肝脏系数与肾脏系数比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与生品组比较，2） P＜0.05。

肾脏系数0.142±0.016 0.146±0.015 0.154±0.022 0.146±0.018 0.135±0.013组别正 常 组生 品 组蒸 制 组甘 草 组莱菔子组n 10 10 10 10 10肝脏系数0.402±0.062 0.480±0.0611）0.416±0.0482）0.428±0.0462）0.419±0.0362）

3.3 5 组小鼠肝肾组织病理形态变化比较 HE 染色结果显示：生品组肝细胞出现明显肿胀，甚至出现空泡，少量的脂肪变性；肾小管上皮细胞可见水肿，肾间质内可见大量炎症细胞浸润。蒸制组、甘草组与莱菔子组肝细胞及肾小管的病变均有不同程度的减轻；莱菔子组肝细胞结构较完整，无明显空泡，肾小管内红染物质和炎症细胞明显减少，管腔结构清晰，减轻作用最为明显。见图1 和图2。

图1 5 组小鼠肝组织HE 染色图（×200）

图2 5 组小鼠肾组织HE 染色图（×200）

3.4 5 组小鼠肝、肾组织脂质过氧化指标比较 与正常组比较，生品组及蒸制组肝、肾组织中GR、SOD 含量均明显降低，MDA 含量明显增多（P＜0.05），甘草组肝组织中SOD 含量降低、MDA 含量增多，肾组织中GR 含量降低（P＜0.05）；与生品组比较，莱菔子组肝、肾组织中GR、SOD 含量均明显增高，MDA 含量明显减少（P＜0.05），甘草组与蒸制组肝组织中GR 含量降低（P＜0.05）。莱菔子组、甘草组与蒸制组组间比较，肝组织GR、SOD 以及肾组织GR、SOD、MDA 含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），仅莱菔子组肝组织MDA 含量较蒸制组明显减少（P＜0.05）。见表4 和表5。

表4 5 组小鼠肝组织中脂质过氧化指标比较（±s）

表4 5 组小鼠肝组织中脂质过氧化指标比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与生品组比较，2） P＜0.05；与蒸制组比较，3） P＜0.05。

组别正 常 组生 品 组蒸 制 组甘 草 组莱菔子组MDA/（μmol/g）28.85±3.32 38.67±5.321）36.12±5.571）35.92±3.111）32.16±3.742）3）n 10 10 10 10 10 GR/（μmol/g）5.30±0.96 2.68±0.661）3.99±1.031）2）4.46±1.202）4.82±1.352）SOD/（ng/g）45.27±6.45 36.77±4.561）38.68±4.531）39.73±4.681）40.87±5.772）

表5 5 组小鼠肾组织中脂质过氧化指标比较（±s）

表5 5 组小鼠肾组织中脂质过氧化指标比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与生品组比较，2） P＜0.05。

组别正 常 组生 品 组蒸 制 组甘 草 组莱菔子组MDA/（μmol/g）48.11±4.47 57.33±6.821）55.54±6.861）52.31±6.32 51.45±6.882）n 10 10 10 10 10 GR/（μmol/g）43.37±7.61 32.05±5.161）35.90±5.041）36.68±5.031）39.35±6.532）SOD/（ng/g）393.71±43.50 345.29±25.421）359.03±29.381）364.15±39.88 378.32±35.142）

4 讨 论

肝、肾损伤是雷公藤毒性中发生率较高的不良反应。本实验结果显示：雷公藤生品可使正常小鼠血清中的肝肾功能指标异常升高，肝脏系数增大，且病理学检查显示肝细胞出现空泡，肾小管上皮细胞出现轻、中度水肿，肾间质内有大量炎症细胞浸润，提示雷公藤生品具有明显的肝肾毒性。炮制后的雷公藤较生品均可不同程度影响改善小鼠肝肾功能指标、肝脏系数，减轻肝细胞和肾小管的病变，其中莱菔子组小鼠肝肾功能指标含量及肝脏系数降低更多，减轻肝细胞和肾小管病变更为明显；莱菔子炮制、甘草炮制及蒸制3 种炮制品比较，肝肾功能指标、肝脏系数、肾脏系数差异均无统计学意义，以上结果提示莱菔子炮制、甘草炮制及蒸制3 种炮制方法均可降低雷公藤的肝肾毒性。

本实验结果显示：生品组小鼠肝肾组织中抗氧化酶GR、SOD 含量明显低于正常组，而脂质过氧化的终产物MDA 含量显著高于正常组，提示生品可产生肝肾组织脂质过氧化损伤。雷公藤经莱菔子炮制、甘草炮制及蒸制后较生品可明显提高肝肾组织中GR、SOD 含量，减少MDA 的产生，3 种炮制品比较，肝肾组织中抗氧化酶活性无明显变化，莱菔子炮制品与蒸制品比较，小鼠肝组织MDA 含量明显减少，提示莱菔子炮制、甘草炮制及蒸制3 种炮制方法可减轻雷公藤对肝肾组织脂质过氧化损伤，其中莱菔子炮制方法降低肝组织脂质过氧化损伤作用较为明显。这一作用可能与炮制后改变或破坏了有毒成分的化学结构，降低毒性成分的含量或产生新的活性物质有关。雷公藤炮制后化学成分的具体变化将是我们下一步深入研究的重要内容。