基于HIF-1α/VEGF通路探讨续苓健骨方对去卵巢大鼠骨代谢和局部血管生成的影响

谢冰颖，李生强，林若慧，黄小彬，黄景文，谢丽华，葛继荣*

（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；2.福建省中医药科学院，福建 福州 350003；3.福建省中西医结合防治骨质疏松重点实验室，福建 福州 350003）

随着我国人口老龄化日趋严重，骨质疏松症已成为我国面临的重要公共健康问题，其中绝经后骨质疏松症（post menopausal osteoporosis，PMOP）占大部分。PMOP 是一种高转换型骨质疏松症，其骨吸收大于骨形成，属于原发性骨质疏松的范畴。大多数女性在绝经后5～10 年骨量进入快速丢失期［1］，往往伴随着疼痛、脊柱变形等严重并发症，危害中老年人的社会健康、心理健康和生活质量，并给社会、家庭经济带来沉重负担，因此，PMOP 的临床防治是亟待解决的问题［2］。

《Nature》报道了成骨与成血管之间的耦联作用［3-4］，提示了血管生成对于新骨形成及防治骨质疏松症的重要意义。目前研究认为血管形成的减少促进了骨质疏松的发生，而局部血管形成的增加则能延缓骨质疏松的进程［5］。低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）介导的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是耦联成血管成骨的重要通路之一。续苓健骨方是福建省中医药科学院葛继荣研究员长期从事骨质疏松症临床研究并结合临床实践总结出来的经验方，具有补肾壮骨、健脾益气、活血化瘀的功效，对PMOP 患者疼痛等临床症状和中医证候改善疗效颇佳［6］。本研究通过建立去卵巢大鼠模型，观察续苓健骨方对卵巢摘除（OVX）大鼠骨密度及骨微结构、股骨远端血管生成和HIF-1α/VEGF信号通路的影响，以探讨本方防治PMOP的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 24只3 月龄SPF 级的Sprague-Dawley 雌性大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，体质量为（210±20）g，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2007-0005，动物质量合格证号为2007000530078。大鼠饲养在福建省中医药科学院比较医学中心，实验动物使用许可证号为SYXK（闽）2016-0005，实验方案经福建省中医药科学院动物实验伦理委员会批准（审批号：FJATCM-IAEC 2018034）。

1.2 实验药品 续苓健骨方（专利号：ZL20151078 4227.4）主要是由川续断、骨碎补、茯苓、白术、红花等组成，方中中药饮片购自厦门燕来福制药有限公司，共122 g。煎煮方法：首煎加冷水没过中药，浸泡30 min，武火煮沸后文火继续煮20 min；次煎再加冷水没过中药，武火煮沸后再文火煮20 min。分别将两次药液过滤后混合，采用旋转蒸发仪浓缩至含生药浓度1.5 g/mL 药液，密封置于4 ℃冰箱保存备用。补佳乐戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司，批号：640A）加适量生理盐水，配制成0.0125 mg/mL 雌二醇药液。

1.3 实验试剂 HIF-1α 一抗（成都正能生物技术有限责任公司，货号：340462）；VEGFA 一抗［艾博抗（上海）贸易有限公司，货号：ab231260］；分化决定簇抗原31（CD31）一抗［艾博抗（上海）贸易有限公司，货号ab124432］；CD31 二抗（美国Jackson ImmunoResearch Laboratories 公司，货号：115-035-003）；大鼠酶联免疫分析试剂盒Ⅰ型前胶原氨基端原肽（P1NP，货号：ml038224）、Ⅰ型胶原交联C 末端肽（S-CTX，货号：ml915040）、雌二醇（E2，货号：ml915040）均购自上海酶联生物科技有限公司。

2 方 法

2.1 分组与造模 24 只大鼠按随机数字表法分成假手术组、模型组、续苓组和雌二醇组，每组6 只。使用4%戊巴比妥钠溶液对4 组大鼠进行注射麻醉，假手术组切除双侧卵巢附近与卵巢体积大小相近的脂肪组织，按文献［7］所述方法对其余3 组大鼠进行双侧卵巢切除术。每只大鼠术后注射青霉素钠溶液8 万U，连续3 d。

2.2 给药方法 术后1 周后开始药物灌胃干预以进行预防性治疗。根据人与大鼠临床等效剂量系数折算法换算，续苓组按体质量1 mL/（100 g·d）灌胃含生药浓度1.5 g/mL 续苓健骨方药液，雌二醇组按体质量1 mL/（100 g·d）灌胃0.0125 mg/mL 雌二醇药液，其余2 组给予等体积生理盐水灌胃。4 组大鼠灌胃次数均为每天1 次，连续灌胃12 周。

2.3 取材及样本采集 末次给药后第2 天，4%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠取材。在大鼠腹主动脉取全血后，离心分离血清置于-80 ℃冰箱保存，用于ELISA 检测；取左胫骨于-20 ℃保存，用于骨密度检测；取左股骨于4%多聚甲醛固定液中固定，用于制备骨组织切片。

2.4 4 组骨密度检测、Masson 染色及骨形态学分析 使用双能X 线骨密度仪（美国Hologic 公司，型号：W 型）扫描测定左胫骨近端骨密度；大鼠左股骨固定48 h 后，采用10%EDTA 脱钙液进行常规脱钙4 周。脱钙结束后，切取股骨远端骨组织，常规脱水包埋切片。将65 ℃烤片后的骨组织切片先进行二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，然后放入丽春红染液浸染，取出冲洗后放入1%磷钼酸溶液脱色，接着取出冲洗后放入5%固绿染液浸染，冲洗干燥后封片。使用倒置显微镜图像系统采集图像后选择股骨干骺线下中央部位测量感兴趣区域（AOI），并使用Image Pro Plus （IPP） 6.0 软件自动分析Masson 染色切片的骨小梁面积百分比（Tb.Ar%）、骨小梁宽度（Tb.Wi）、骨小梁间距（Tb.Sp）。

2.5 4 组血清E2、P1NP、S-CTX 水平检测 按照ELISA 试剂盒说明书上的实验步骤分别进行标准品孔和样品加样、酶标试剂、洗涤、显色。反应结束后用吸收光酶标仪检测，记录450 nm 处波长，计算血清E2、P1NP、S-CTX 水平。

2.6 4 组CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表达水平 采用免疫组织化学Envision TM Systems 法染色目的蛋白，通过IPP 软件选取棕黄色或棕褐色作为蛋白阳性标识，自动分析统计免疫组化染色切片的累计光密度值、阳性表达面积，并计算出4 个视野下的平均光密度值（累计光密度值/阳性表达面积）。平均光密度值越大，免疫组化（IHC）的阳性表达越强，表明蛋白表达水平就越高。

2.7 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件对数据进行统计学处理。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较方差齐采用LSD-t 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 4 组左胫骨近端骨密度比较 见表1。

表1 4 组左胫骨近端骨密度比较（±s） g/cm2

表1 4 组左胫骨近端骨密度比较（±s） g/cm2

注：与假手术组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

骨密度0.394±0.008 0.307±0.0151）0.354±0.0131）2）0.349±0.0201）2）组别假手术组模 型 组续 苓 组雌二醇组n6 6 6 6

3.2 4组骨形态及Tb.Ar%、Tb.Wi、Tb.Sp比较 Masson 染色后比较4 组骨形态：与对照组比较，模型组骨小梁较为稀疏，间距较大；与模型组比较，续苓组、雌二醇组骨小梁较紧密，间距较小。见图1。骨形态学参数比较见表2。

图1 4 组股骨远端矢状面Masson 染色图

表2 4 组Tb.Ar%、Tb.Wi、Tb.Sp 比较（±s）

表2 4 组Tb.Ar%、Tb.Wi、Tb.Sp 比较（±s）

注：与假手术组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

Tb.Sp/μm 83.134±21.726 171.276±84.1521）69.497±33.0192）62.771±26.7752）组别假手术组模 型 组续 苓 组雌二醇组n6 6 6 6 Tb.Ar %37.460±6.816 16.525±5.1671）33.227±7.7432）28.763±5.1131）2）Tb.Wi/μm 50.612±24.282 30.692±8.913 31.001±11.121 29.114±12.592

3.3 4 组大鼠血清E2、P1NP、S-CTX 水平比较 见表3。

表3 4 组血清E2、P1NP、S-CTX 水平比较（±s）

表3 4 组血清E2、P1NP、S-CTX 水平比较（±s）

注：与假手术组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

S-CTX/（nmol/L）8.246±0.385 9.302±0.3071）8.536±0.2512）8.767±0.971组别假手术组模 型 组续 苓 组雌二醇组n6 6 6 6 E2 /（ng/L）148.344±2.478 139.183±4.8151）146.965±4.9842）154.139±6.7632）P1NP/（pg/mL）73.437±6.189 65.295±5.8251）81.279±4.5061）2）87.590±2.0941）2）

3.4 4 组骨微结构及CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组的股骨远端切片视野中棕黄色染色物分散、稀疏，伴有大量脂肪细胞；与模型组比较，续苓组、雌二醇组棕黄色染色物增粗，面积增大，连续性较好，伴随脂肪细胞及空泡的减少，见图2。4 组大鼠左股骨远端CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表达水平，见表4。

图2 4 组CD31、HIF-1α、VEGF 免疫组化染色图（×200）

表4 4 组左股骨远端CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表达水平比较（±s）

表4 4 组左股骨远端CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表达水平比较（±s）

注：与假手术组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

VEGF 0.307±0.043 0.256±0.0351）0.353±0.0421）2）0.324±0.0142）组别假手术组模 型 组续 苓 组雌二醇组n6 6 6 6 CD31 0.383±0.032 0.365±0.049 0.520±0.0751）2）0.529±0.0281）2）HIF-1α 0.290±0.034 0.204±0.0271）0.256±0.0422）0.264±0.0342）

4 讨 论

中医学认为PMOP 属于“骨痿”“骨枯”范畴，其发病病机是以肾虚为主，并与脾、肝相关［8］。绝经后妇女肾精不足，无以滋养骨骼，最终引发骨痿。卵巢切除后大鼠雌激素水平降低，骨量显著丢失，较好地模拟了绝经后骨质疏松症的病理状况。本研究结果显示：与模型组比较，续苓组骨小梁面积百分比（Tb.Ar%）、骨小梁宽度（Tb.Wi）增加，骨小梁间距（Tb.Sp）缩小，表明续苓健骨方改善了OVX大鼠骨小梁形态和骨微结构。

成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡是维持体内骨量的重要因素。雌激素缺乏是绝经后骨质疏松症重要的发病机制之一［9］。雌激素水平降低会减弱对破骨细胞的抑制作用，破骨细胞的数量增加、凋亡减少、寿命延长，导致骨吸收功能增强，从而使骨形成与骨吸收的耦联失衡，导致骨质疏松症。P1NP 是体内成骨细胞的活性和新骨形成的特异性敏感指标，S-CTX 是骨吸收活性特异指标［10］。本研究结果显示：续苓组大鼠的血清中E2、P1NP 升高，S-CTX 显著降低，可见续苓健骨方缓解了模型组大鼠雌激素下降的状态，抑制骨吸收能力，同时增加骨形成能力，从而提高骨密度。

现代研究表明：血瘀的生物学基础涉及血管内皮细胞损伤、微循环障碍等血管因素的失调［11］。CD31 是血管内皮细胞特征性标志物之一，常用于检测血管新生。伴随雌激素水平的下降，绝经后骨质疏松症骨内血管数量也相应减少［12］。HIF-1α/VEGF 是偶联骨血管形成及骨形成的重要通路之一［13］。HIF-1α 是具有转录活性的重要因子，是受损伤组织中最为重要的成血管诱导因子［14-15］。VEGF是HIF-1α 下游主要的血管相关性靶基因，可通过诱导新血管生成并使其侵入参与骨重建的过程［16-17］。本研究结果显示：模型组股骨远端CD31、HIF-1α、VEGF 蛋白表达降低，而续苓健骨方干预后上述指标显著升高，说明续苓健骨方促进血管生成，改善微循环障碍，这可能与其对HIF-1α/VEGF 信号通路调控有关。

综上所述，续苓健骨方能上调HIF-1α/VEGF信号通路的表达，促进OVX 大鼠股骨远端血管生成，增加骨形成；同时升高血清E2，抑制骨吸收，从而改善骨微结构，缓解骨代谢失衡状态，达到骨保护的目的。