银川市2016—2022年手足口病柯萨奇病毒A6型分离株VP1基因特征分析

秦 红,张伟宏,马 杰,纳 玮,马晓瑞,王彦海,王光俊,樊瑞军

柯萨奇病毒A6型(CV-A6)属于小RNA病毒肠道科肠道病毒属A组,其病毒基因组为单股正链RNA,原型株Gdula株是1949年在美国纽约被首次分离出的[1]。自2008年芬兰报道由CV-A6引起的手足口病暴发以来[2-3],全球多个国家包括中国的部分地区都暴发了以CV-A6为主要病原体的手足口病。法国、日本和西班牙等国均有CV-A6引起暴发疫情的相关报道[4-6]。中国北京、深圳和广东等地区CV-A6阳性率也较高[7-9]。相关研究[3,7-8,10-12]表明,2013年以后CV-A6引起手足口病的增长趋势明显,已逐渐成为手足口病肠道病毒的优势基因型。银川市手足口病监测数据显示,肠道病毒CV-A6已经成为2016—2022年银川市手足口病的优势病原体。本研究通过对2016—2022年银川市手足口病病原学监测标本中分离培养出的CV-A6毒株进行基因测序、同源性分析及氨基酸变异位点比较,阐明银川市CV-A6分离株的基因特征,为手足口病的防治工作提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 所有标本均来源于2016—2022年银川市手足口病哨点监测医院,标本严格按照《手足口病预防控制指南》(2009版)要求采集和运送,保存于-80 ℃超低温冰箱,对复核后确认CV-A6核酸阳性的标本进行细胞组织培养,分离病毒。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离培养 将CV-A6核酸阳性的标本解冻混匀,接种到生长状态良好的单层人横纹肌肉瘤(RD)细胞,设置正常细胞对照,放置于含5% CO2的细胞培养箱中,温度设置为37 ℃,静置培养。于7 d 内每天观察细胞的生长情况以及有无病变细胞,当观察到病变细胞达到75%时,收集培养物及上清液,-80 ℃冻存备用。如果7 d 内未出现细胞病变,则第2次传代。若经过2次传代均未出现细胞病变则判定病毒分离结果为阴性。

1.2.2 核酸提取 将收集的培养物及上清液解冻混匀,应用上海之江生物科技股份有限公司全自动核酸提取仪器(型号：EX9600)及配套核酸提取试剂盒,按照说明书要求进行病毒RNA核酸提取。

1.2.3 VP1区基因全长序列PCR检测及测序 采用一步法聚合酶链式反应(RT-PCR)进行VP1区全长基因片段扩增。PCR反应体系共20 μL [2*TS One-Step Reaction Mix 10 μL、One-Step Enzyme Mix 0.4 μL、RNase-Free Water 3.8 μL、上下游引物(10 μM)各0.4 μL、病毒RNA模板5 μL]。肠道病毒A组引物(486/488)：5′- TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNCC -3′,5′ -TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNCC -3′;引物(040/011)：5′-ATGTAYRTICCIMCIGGIGC -3′,5′-GCICCIGAYTGITGICCRAA -3′;反应程序为45 ℃、30 min,94 ℃、5 min;(94 ℃、30 s,50 ℃、30 s,72 ℃、1 min),40个循环;72 ℃、10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪下观察是否出现符合预期长度的目的条带。将PCR扩增阳性产物在冷链条件下送至武汉昆泰锐生物科技有限公司进行双向测序。RT-PCR扩增使用美国Bio-rad伯乐T100梯度型PCR仪,一步法RT-PCR 试剂购自北京全式金生物技术有限公司(批号Q20721),扩增引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 序列拼接、构建发育树及同源性分析 原始序列使用DNASTAR SeqMan软件进行拼接和整理,得到病毒分离株VP1区完整基因序列。序列进行“Blast”比对定型,同时下载CV-A6的原型株Gdula(AY421764 -USA-1949)及国内[13]CV-A6代表序列作为参考序列;应用MEGA 7.0 软件将本研究中拼接好的83株CV-A6序列和参考序列的核苷酸进行比对;采用邻接法构建基于VP1基因序列的系统发育树,Bootstrap值设置为1 000;应用DNAStar MegAlign软件进行核苷酸和氨基酸相似性计算,分析同源性的区间。

1.2.5 氨基酸变异位点分析 利用MEGA 7.0 软件将比对后的VP1全长基因核苷酸序列翻译为氨基酸序列,与原型株进行比较查询存在的氨基酸变异位点。

2 结果

2.1 CV-A6毒株分离培养 2016—2022年银川市共收集到手足口病肠道病毒核酸阳性标本1 923份,其中CV-A6核酸阳性标本814份,占比42.3%。采用RD细胞进行病毒培养分离得到CV-A6毒株90株。

2.2 CV-A6分离株的VP1区扩增和测序 使用一步法RT-PCR扩增出CV-A6分离株基因片段,测序后经拼接整理,成功获得83株CV-A6 VP1区全长序列,登录NCBI网站进行Blast比对,结果均显示为CV-A6型别。其中2016年11株,2017年12株,2018年37株,2019年6株,2020年4株,2021年8株,2022年5株。

2.3 基于CV-A6分离株完整VP1区构建系统发育树 为分析2016—2022年银川市83株CV-A6分离株的VP1区核苷酸进化特点,从NCBI网站上筛选下载CV-A6的原型株Gdula株(AY421764 -USA-1949)以及具有代表性的参考序列共64条,分别来自美国、日本、西班牙、法国、印度、芬兰及中国(含河南省、山东省、上海市、江苏省、福建省、天津市、广东省、甘肃省、河北省、山西省、云南省、辽宁省、江西省、湖南省、吉林省、浙江省、四川省等省、市)。CV-A6的原型株Gdula株的分离时间最早,其余毒株分离时间均在1992—2015年,将银川市83株CV-A6分离株与参考序列共同构建基于VP1区全长序列的系统进发育树。将本研究中全部147条CV-A6的序列分为A、B、C和D 4种基因型。A基因型只有1949年美国分离的原型株Gdula株(AY421764)1株;B基因型由中国的4株组成,分别是1992年山东株(JQ364886)、2004年广东株(KP143074)、2005年广东株(KP143075)和2007年广东株(KP143078);C基因型由1996年中国山东株(JQ364887)和2008年印度株(JN203517)组成;D基因型由其余140株组成。而D基因型又分为D1、D2和D3共3个亚型。D1亚型来自日本、西班牙和法国;D2亚型来自中国和日本;D3亚型来自中国、日本、芬兰、西班牙和法国,其中D3亚型又包括D3a和D3b两个分支。在本研究构建的系统发育树图中,2016—2022年银川市83株CV-A6分离株与D3亚型的D3a分支参考序列聚集为1支。

2.4 CV-A6的VP1区全长序列同源性分析 本研究中银川市83株CV-A6分离株的VP1区基因全长均为915 bp,共编码305个氨基酸。与CV-A6原型株Gdula株(AY421764 -USA-1949)进行对比均未发现核苷酸的插入或缺失。对2016—2022年银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析,发现银川市83株CV-A6分离株VP1区序列之间的核苷酸相似性为90.7%～99.9%,氨基酸相似性为86.6%～100.0%;银川市83株CV-A6分离株与CV-A6原型株之间核苷酸相似性为82.1%～84.1%,氨基酸相似性为76.2%～80.5%。这表明2016—2022年银川市83株CV-A6流行株之间同源性较高,没有出现较大的进化,而银川市83株CV-A6分离株与原型株之间遗传距离较远。对2016—2022年银川市83株CV-A6分离株与其他基因型或亚型VP1区序列进行同源性分析,结果显示83株CV-A6分离株与 B基因型参考序列核苷酸相似性为82.6%～85.2%,氨基酸相似性为77.2%～84.4%;与C基因型参考序列核苷酸相似性为82.8%～86.0%,氨基酸相似性为76.5%～82.1%;与 D基因型参考序列核苷酸相似性为85.9%～98.9%,氨基酸相似性为80.8%～99.3%;与 D1基因亚型参考序列核苷酸相似性为87.9%～94.2%,氨基酸相似性为83.7%～92.8%;与 D2基因亚型参考序列核苷酸相似性为85.9%～91.4%,氨基酸相似性为80.8%～90.2%;与 D3基因亚型参考序列核苷酸相似性为91.0%～98.9%,氨基酸相似性为86.6%～99.3%;与 D3基因亚型D3a分支参考序列核苷酸相似性为91.4%～98.9%,氨基酸相似性为88.6%～99.3%;与 D3基因亚型D3b分支参考序列核苷酸相似性为91.0%～95.7%,氨基酸相似性为86.6%～94.5%。由此可见2016—2022年银川市83株CV-A6分离株基因序列与D3基因亚型中的D3a分支参考序列同源性最高,推断银川市83株CV-A6分离株均属于D3a分支。2016—2022年银川市83株CV-A6分离株与其他国家流行株比较,发现其与2010年法国株(HE572928、HE572938)同源性最高,核苷酸相似性为93.4%～97.2%,氨基酸相似性为90.2%～96.1%;与中国流行株比较,发现其与来自上海市、云南省、河南省、天津市、湖南省、辽宁省、江西省、山东省的参考株同源性比较高,见表1。提示银川市2016—2022年CV-A6流行株可能存在多条传播链。

表1 银川市83株CV-A6分离株与其他地区流行株同源性分析(%)

2.5 CV-A6分离株的VP1区编码氨基酸变异位点分析 将本研究中银川市83株CV-A6分离株的VP1区核苷酸翻译的氨基酸序列与CV-A6原型株Gdula株(AY421764-USA-1949)进行比较,确定氨基酸的变异位点,应用MEGA7.0软件进行分析,没有发现氨基酸插入或缺失的情况,均是在原有氨基酸位点发生替换或突变。与原型株比较,本研究中银川市83株CV-A6分离株共存在47个氨基酸位点的变异,将仅出现1次的15个随机突变去除,对其余32个氨基酸变异位点进行分析,见表2。

表2 2016—2022年银川市CV-A6的VP1区全长氨基酸序列变异比较

3 讨论

手足口病是由多种肠道病毒(EV)引起的急性传染病,常见的主要临床症状为手、足皮肤及口腔皮疹或疱疹,该病属于自限性疾病,极少数患者会出现脑膜炎、脑炎、急性迟缓性麻痹及神经源性肺水肿等症状,严重时可致患者死亡[14]。本病具有传播快、流行性强的特点,多发于5岁以下儿童[15]。手足口病作为一种常见的传染病严重危害着公众健康,我国于2008年将其纳入法定丙类传染病报告管理[16],随后建立起全国手足口病监测网络实验室,逐渐实现规范化管理。银川市于2011年加入全国手足口病监测网络实验室,但是仅按照监测要求对肠道病毒EV-A71型和柯萨奇病毒A-16型进行实验室监测。2013年以后中国多地出现CV-A6,提示CV-A6已经成为引起手足口病的重要病原体之一,因此应将CV-A6型别鉴定纳入常规监测。

在银川市2016—2022年手足口病病原学监测的1 923份核酸阳性标本中,CV-A6阳性标本有814份,占比42.3%。说明CV-A6已经成为近年来引起银川市手足口病的优势病原体,所以对CV-A6进行持续监测尤为重要。武晶等[17]研究报道北京市丰台区2015—2019年手足口病优势病原体为CV-A6,占比37.71%;王浩权等[18]研究报道上海市嘉定区2015—2020年手足口病优势病原体也是CV-A6,占比57.07%;梁月玲等[19]研究报道CV-A6成为2017—2018年宁夏回族自治区手足口病的主要病原体之一;本研究结果与相关文献报道相似。根据系统进化结果分析,发现CV-A6的A、B和C基因型比较稳定,而D基因型在全球多地区流行。银川市2016—2022年的83株CV-A6分离株均属于D3基因亚型的D3a分支,未检测到其他基因型,说明近年来CV-A6的D3a单一基因型一直在银川市持续传播。这与SONG等[13]的研究中2014年以后我国除2014年新疆两株、2015年云南1株分离株以外所有CV-A6分离株均位于D3基因亚型的D3a分支的研究结果一致;同时与梁月玲等[19]研究2017—2018年宁夏回族自治区流行的CV-A6毒株均为D3a基因亚型的结果相符。但与袁芳等[20]研究报道的2013—2015年宁夏61株CV-A6分离株分布在D1和D2这两个分支,并且大部分集中在D2分支的结果不同。由此可见,CV-A6不仅是银川市手足口病的主要病原体之一,而且其基因亚型在流行过程中不断发生改变。通过同源性分析发现,银川市83株CV-A6分离株与D3a基因亚型的参考序列同源性最高,再次印证了2016—2022年引起银川市手足口病的CV-A6流行株属于D3基因亚型D3a分支。银川市2016—2022年CV-A6与我国上海市、云南省、河南省、天津市、湖南省、辽宁省、江西省、山东省等的CV-A6流行株亲缘关系较近,说明银川市CV-A6与国内其他地区处于共同循环的状态,流行趋势基本一致,可能存在多条传播链。将本研究中83株CV-A6分离株与原型株Gdula株进行氨基酸突变位点对比,发现银川市83株CV-A6的VP1区蛋白有32个氨基酸位点存在差异,其中第8、10、14、32、98、160、194、261、279和305个氨基酸位点变异率100%,其他氨基酸位点部分变异。变异是否使其毒力增强是否导致银川市近年来CV-A6引起的手足口病比例上升等,还需要后续的监测数据进行证实。

综上所述,银川市2016—2022年引起手足口病的CV-A6分离株属于D3a基因亚型分支,其流行存在多条传播链。本研究证实了CV-A6已经成为银川市近年来引起手足口病的重要病原体,完善了本地区手足口病流行株的分子进化资料。在今后的手足口病病原学监测工作中应加强对CV-A6的持续监测,通过核酸检测和基因测序等方法,密切监测病原谱的变化,为手足口病的防治工作提供科学的参考依据,同时为研发有效的针对CV-A6感染的疫苗提供参考数据。