IL-6、STAT3和Cyclin D1在结直肠腺癌组织中表达及临床意义

申东洋,赵 帅,尚 静,陶月佳,宋小萍,黄允宁

结直肠癌(CRC)是全球第三大恶性肿瘤,其癌症死亡率居全球第二。2020年全球新增193万结直肠癌病例,死亡病例约94万例。针对高发病率和致死率的结直肠癌,虽然现有的检查和治疗可以实现诊治,达到降低死亡率的效果,但对于发生侵袭、转移的晚期肿瘤却收效甚微,因此从分子学角度寻找预后标志物迫在眉睫。恶性肿瘤是一类机体细胞不受调控而发生恶性增殖的疾病,其与细胞周期失调密切相关,而调节细胞周期的细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)则在多种恶性肿瘤(如胃癌)中存在异常高表达[1-3]。炎症与肿瘤反应密切相关[4],炎症细胞分泌的白细胞介素6(IL-6)通过信号传导及转录激活因子3(STAT3)激活靶基因的转录,可影响机体细胞的增殖、凋亡等多种生命活动,其中这些因子异常表达与结直肠癌的发生、发展密切相关[5]。本研究主要探讨IL-6、STAT3 和Cyclin D1在结直肠腺癌组织中的表达情况,并分析其与临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2014—2016年在宁夏回族自治区人民医院进行结直肠腺癌根治术患者80例,病例及随访资料完整。术前均未接受放、化疗且未患其他恶性肿瘤。其中男性50例,女性30例,男女比例1∶0.6;年龄32～93岁,平均年龄(66.5±11.5)岁。本研究分析结直肠腺癌组织中IL-6、STAT3 和Cyclin D1表达分别与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、临床分期的关系。预后分析,80例研究对象中死亡35例,其中男性24例,女性11例,年龄32～93岁,平均生存期为17.9个月。本研究已通过宁夏回族自治区人民医院医学伦理委员会的批准。

1.2 方法与判读 采用免疫组织化学法检测癌和癌旁组织中IL-6、STAT3、Cyclin D1表达用到的抗体有兔抗人IL-6单克隆抗体(浓度1∶400,abcam公司);兔抗人STAT3 多克隆抗体和兔抗人Cyclin D1多克隆抗体(浓度1∶200,Bioss公司)。将3 μm组织切片经枸橼酸钠(pH为6.0)抗原修复10 min,一抗4 ℃过夜,二抗(兔超敏二步法试剂,中杉金桥公司)室温孵育1 h,DAB显色1.5 min,苏木素复染封片。IL-6、STAT3和Cyclin D1主要定位于细胞核、细胞浆,呈浅黄至棕褐色。病理医师双盲阅片,观察目标细胞染色强度并计算阳性细胞百分比。染色强度方面,不着色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;阳性细胞率<25%为1分,25%～50%为2分,51%～75%为3分,阳性细胞率>75%为4分。2项分值相乘后,结果在0～7分为低表达(-),8～12 分为高表达(+)。

1.3 统计学方法 运用SPSS 26.0统计软件,相关性采用 Spearman分析;生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank检验,多因素分析采用Cox比例风险模型;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-6、STAT3和Cyclin D1在CRC及癌旁组织中的表达 CRC组织中IL-6、STAT3和Cyclin D1阳性表达率分别为53.8%(43/80)、63.8%(51/80)、62.5%(50/80),这均明显高于癌旁组织的32.5%(26/80)、25.0%(20/80)、15.0%(12/80),两者比较差异有统计学意义,见表1与图1(目次后)。

表1 IL-6、STAT3和Cyclin D1在结直肠腺癌和癌旁组织的表达

2.2 CRC组织中 IL-6、STAT3和Cyclin D1表达与临床病理的关系 IL-6表达与患者的性别、年龄、腺癌部位、肿瘤大小、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、临床分期均无关(P>0.05);STAT3表达与患者的性别、年龄、腺癌部位、肿瘤大小、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、远处转移均无关(P>0.05),而与淋巴结转移及临床分期密切相关(P<0.05);Cyclin D1表达与患者的性别、年龄、腺癌部位、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关,而与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及临床分期密切相关(P<0.05),见表2。

表2 在CRC中 IL-6、STAT3和Cyclin D1表达与临床病理的关系[n(%)]

2.3 CRC组织中IL-6、STAT3、Cyclin D1表达的关系 在CRC组织中IL-6与STAT3表达呈正相关(r=0.270,P<0.05);STAT3和Cyclin D1表达呈正相关(r=0.300,P<0.05);IL-6和Cyclin D1表达呈正相关(r=0.369,P<0.05)。

2.4 CRC组织中IL-6、STAT3和Cyciln D1表达水平与患者预后的关系 在CRC组织中,IL-6和STAT3表达阳性组与阴性组患者术后总生存期比较差异无统计学意义(P>0.05),见图2A、B(目次后);Cyciln D1阴性组患者的术后总生存期明显长于Cyciln D1阳性组(P<0.05),见图2C(目次后)。

2.5 影响CRC患者预后的相关因素分析 80例CRC患者的单因素分析表明,肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期、Cyclin D1表达是影响结直肠腺癌预后的危险因素(P<0.05),而患者的性别、年龄、肿瘤部位及其大小、IL-6、STAT3均不是影响结直肠腺癌预后的危险因素(P>0.05)。多因素分析表明,肿瘤的分化程度、Cyclin D1表达是影响结直肠腺癌患者预后的独立危险因素(P<0.05);肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、临床分期则不是影响结直肠腺癌预后的独立危险因素(P>0.05),见表3。

表3 80例CRC患者的单因素及多因素预后分析[n(%)]

2.6 生物学数据库中Cyclin D1表达分析 本研究评估来自GEPIA及UALCAN数据库的结肠癌(COAD)和直肠癌(READ)研究中Cyclin D1转录水平,发现COAD和READ中的Cyclin D1转录水平显著高于正常组织(P<0.05),见图3(目次后)。

2.7 生物学数据库中IL-6、STAT3、Cyclin D1表达的关系 本研究评估来自GEPIA及UALCAN数据库中IL-6、STAT3、Cyclin D1表达的关系显示,在CRC中IL-6和STAT3表达呈正相关(P<0.05);STAT3和Cyclin D1表达呈正相关(P<0.05)。

3 讨论

结直肠癌起源于肠黏膜上皮的消化道肿瘤,它也是全球癌症相关死亡的元凶之一。IL-6在肿瘤微环境中通过激活GP130/JAK/STAT3信号通路,促进肿瘤细胞增殖和免疫逃逸[6],阻断其通路可实现抗癌特性[7-9]。IL-6过表达常见于胃癌、食管癌等[10-11]。关于IL-6表达的部分预后研究相互矛盾,如有研究称IL-6过表达患者预后差、复发率高,而低表达患者则预后更好[12];另有报道IL-6与肿瘤临床分期、远处转移有关,但与预后无关[13];还有认为IL-6与肿瘤远处转移有关,但与分期及预后无关[14]。这些矛盾结果可解释为：①检测IL-6表达的方法及阈值不同;②肿瘤的进展是复杂的动态过程,IL-6表达受多种因素影响。本研究表明,IL-6在CRC中高表达,但与患者临床病理特征及预后无关。即使CRC组织中IL-6水平升高,其促进肿瘤进展的作用也仍需进一步研究。

STAT3是STAT家族中兼具信号转导及激活转录双重功能的关键成员,其负责向细胞核传递信号,调节基因表达,如细胞增殖、炎症反应等[15]。在胰腺癌、胃癌中,STAT3促进肿瘤进展、致使预后不良[16-18],因此STAT3成为抗癌药物研究靶点[19]。本研究发现,STAT3在癌组织中过表达,且与肿瘤的临床分期及淋巴结转移相关,表明STAT3与肿瘤进展有关。在结直肠癌模型中,升高IL-6水平可构成性激活STAT3,导致肿瘤细胞增殖和体积增大[5],而降低IL-6水平可抑制STAT3激活,促进肿瘤细胞凋亡[20]。本研究相关性分析显示IL-6与STAT3在CRC中表达呈正相关。这些研究结果表明,IL-6和STAT3共同参与CRC的进展过程。

细胞周期蛋白与肿瘤发生、发展有关,且在多种实体瘤中过表达,如乳腺癌、甲状腺癌等[21-22]。有研究发现,靶向Cyclin D1可有效治疗CRC[23]。Cyclin D1在CRC中高表达,且与肿瘤临床特征密切相关[24]。UALCAN数据库显示,CRC中的Cyclin D1水平显著高于正常组织,且在基于疾病分期、体重、年龄、淋巴结转移的亚组分析中,也显著高于健康人群。本研究中,Cyclin D1在CRC中过表达,且与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、临床分期相关。生存分析显示,肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期只是影响患者预后的主要因素,而肿瘤分化程度和Cyclin D1则是影响患者预后的独立危险因素,即肿瘤低分化患者的死亡风险升高2.133倍;Cyclin D1过表达患者死亡风险升高2.353倍。本研究相关性分析显示,STAT3与Cyclin D1的表达呈正相关,这与数据库验证结果一致。有研究发现,激活STAT3信号可过表达Cyclin D1并增强细胞活力[25],分析其原因可能是活化的STAT3促进Cyclin D1表达,共同参与调节细胞周期的过程。

综上所述,IL-6、STAT3和Cyclin D1在结直肠腺癌中过表达。IL-6与STAT3的表达呈正相关,STAT3与Cyclin D1的表达呈正相关。Cyclin D1是影响结直肠腺癌预后的独立危险因素。因此,Cyclin D1可以作为判断结直肠腺癌临床进展及预后的指标,具有研究价值。