双氢青蒿素对脑胶质瘤小鼠血清白细胞介素-10和白细胞介素-12表达的影响

詹增钦,苏 敏,伍 鑫,郑钟洪

(1.广州开发区医院肿瘤科,广东 广州 510730;2.广州中医药大学金沙洲医院国际肿瘤医疗中心)

在脑胶质瘤患者中,炎性反应伴随着整个癌变过程,癌变反应会影响患者体内细胞的增殖、肿瘤血管生存等,并且对机体的免疫反应产生巨大影响,这显然会影响到患者血清中与上述反应有关的IL-10和IL-12值,同时许多文献和研究支撑了双氢青蒿素通过信号通路介导着IL-10和IL-12的表达这一观点[1],但双氢青蒿素是否能通过改变IL-10和IL-12的表达从而缓解脑胶质瘤的研究尚未报道,并没有相关的动物实验具体证实。对此,本研究将通过构建脑胶质瘤动物模型并施加DHA干预,探讨DHA是否通过介导IL-10和IL-12的表达来影响小鼠的脑胶质瘤及其作用机制并以此展开动物实验,为脑胶质瘤新药的研发提供依据。

1 资料与方法

1.1实验动物:本次研究经过本院医学伦理委员会同意。购买8周龄SPF级Wistar小鼠24只,雌雄各半,购自广东省医学实验动物中心[生产许可证号:SCXK(粤)2018-0002],体重18～22 g,并购买C6小鼠脑胶质瘤细胞,购自广东省医学实验动物中心,该实验所有处理方法均经过伦理委员会批准。

1.2造模

1.2.1C6胶质瘤干细胞悬液制备:细胞悬液制备:实验用C6细胞株培养于含10%胎牛血清及加1%双抗的DMEM培养液中,置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养,经胰酶消化传代,计数,每日观察细胞的生长情况、于造模前收集生长于75 cm2培养瓶中对数周期生长的C6细胞,1 000 r/min离心5 min,弃上清,计数,调浓度为5×107/ml,为保证细胞活性,于离心管置于冰上。

1.2.2建立脑胶质瘤小鼠动物模型:术前小鼠禁食半天,不禁水,采用0.3%戊巴比妥钠,以3.5 mg/kg腹腔注射麻醉,头部备皮,络合碘消毒,以两目内眦连线中点为起点,沿正中矢状线,切开一寸,充分暴露颅骨,后将小鼠外耳道对称固定于立体定位仪两耳针处,门齿固定于前。根据小鼠头部解剖图谱,将前自与正中线的交点定为原点,原点右3.4 mm,后1.2 mm,牙科钻钻孔。用微量注射器抽吸10闪细胞悬液,沿骨孔缓慢垂直进针至硬脑膜下5.8 mm,退出0.1 mm,给注入细胞以空间,防止溢液,将悬液缓慢注入,用时10 min,注射完毕后留针5 min,后缓慢拔出,用骨蜡封口。将小鼠术口缝合,络合碘再次消毒,放入笼子,用干净垫料保温。待造模7 d,动物活体成像仪检测裸鼠肿瘤荧光量达,1×105时,认为造模成功,本次造模成功率为90%。

1.3分组与给药:实验前适应性喂养1 w,温度(24±1)℃,湿度(50±5)%,明暗各12 h(AM 8∶00～PM8∶00),自由进食及饮水,随机分为空白对照组、模型对照组、双氢青蒿素低剂量组、双氢青蒿素高剂量组各6只。空白对照组选取正常的小鼠,除空白对照组以外的所有小鼠均选用造模成功的小鼠。各组小鼠自由进食,双氢青蒿素低剂量组给予25 mg/kg双氢青蒿素灌胃,双氢青蒿素高剂量组给予50 mg/kg双氢青蒿素灌胃,模型对照组同时灌胃等量生理盐水,空白对照组不做任何处理,1次/d,持续15 d。

1.4IL-10和IL-12的检测:实验结束后,各组小鼠禁食1 d,禁水半天,用4%水合氯醛按0.1 ml/10 g的标准腹腔注射麻醉小鼠,然后固定小鼠四肢,心脏采血3～5 ml,将抽取的小鼠血液放入血清分离管中,室温放置30 min,以3 000 r/min离心10 min分离血清,吸取血清放入1.5 ml离心管中,4 ℃保存。按小鼠IL-10、IL-12酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒说明书要求在酶联免疫检测仪上检测IL-10、IL-12的含量:制备好的离心管室温下平衡30 min,每孔加样100 μl,盖上板膜,37℃孵育2 h,弃去液体,甩干;每孔加入生物素标记的抗体工作液100 μl,盖上板膜,37℃孵育1 h,弃去液体,甩干;洗板3次,每次浸泡2 min,每孔200 μl洗液;每孔加HRP标记的亲和素工作液100 μl,盖上板膜,37℃孵育1 h,弃去液体,甩干,洗板5次,每次浸泡2 min,每孔200 μl洗液;每孔加底物溶液90 μl,37℃避光显色15～30 min;每孔加入终止液50 μl,终止反应;反应终止后5 min内用酶标仪在450nm波长处测量吸光度OD值。

1.5统计学处理:采用SPSS软件进行方差分析及t检验。

2 结果

与空白对照组的小鼠相比,模型对照组小鼠血清中IL-10和IL-12的含量均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01);与模型对照组小鼠相比,双氢青蒿素低剂量组小鼠血清中IL-10和IL-12的水平均明显下降,差异有统计学意义(P<0.01),双氢青蒿素高剂量组小鼠血清中的IL-10和IL-12的水平也明显下降,且下降程度比双氢青蒿素低剂量组的更为突出,更加趋近正常组小鼠血清中IL-10和IL-12的水平值。

表1 各组小鼠IL-10和IL-12水平比较

3 讨论

恶性胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,约占颅内肿瘤总数的40%～50%[2]。胶质瘤治疗包括手术、放疗、化疗,其结果不尽人意。进行了手术切除等综合治疗的高级别胶质瘤(脑胶质母细胞瘤GBM)患者的中位生存时间只有12～14个月[3]。它的主要问题和阻碍来源于恶性肿瘤中具备广泛增殖和潜伏侵袭能力的神经胶质瘤细胞。新的治疗方式需要有效的治疗策略,评价新中药化合物能否抑制神经胶质瘤细胞异常生长,或是改变其与脑胶质瘤相关的生理参数指标,并在临床试验中用于神经胶质瘤的治疗是目前的研发策略。迄今为止,人们一直在寻找新的、更有效的化学制剂来对抗这种致命疾病,显然这些问题已成为脑胶质瘤治疗领域的主要研究热点。青蒿素是从草本植物中分离出来的,国内常使用青蒿素用于治疗疟疾,并显示出了其药优秀的效果。对青蒿素的化学修饰开发了某些类似物,包括双氢青蒿素,在许多研究人员的文献中已经揭示了青蒿素衍生物不仅有着比青蒿素更优越抗疟效果,并且其衍生物在乳腺癌、卵巢癌和肺癌等恶性肿瘤中展现出了青蒿素所缺乏的抑制增殖潜力和抗增殖作用[4]。更值得一提的是,使用双氢青蒿素作为抗肿瘤药物是对正常细胞无毒的[5],其抗增殖作用可用于治疗。胶质瘤细胞对化疗有抵抗性,对传统西药有较高耐药性,而双氢青蒿素这类传统中药衍生物通常会比传统西药和机械治疗有着更低的耐药性以及更小的副作用,这些都说明了双氢青蒿素是脑胶质瘤治疗新药开发或改善现有治疗策略的潜在药物。IL-10是一种抗炎细胞因子[6],在预防炎性反应和自身免疫中发挥重要作用,在肿瘤的发生进程中一直是与炎性反应息息相关的,IL-10反映了机体的炎性反应情况,这对肿瘤的生长情况有着重要的意义。IL-12则是由抗原提呈细胞(单核巨噬细胞、B细胞及树突细胞等)分泌的,具有很多种生物活性的细胞因子[7],如诱导IFN-γ的产生、激活NK/LAK细胞并促进二者的杀伤作用、促进树突细胞成熟、促进T细胞的增殖、抑制血管生成等。它不仅是免疫应答过程中的关键的因子,还可直接调节T细胞和NK细胞的增殖、细胞毒性和淋巴因子的产生,还可使多种免疫效应细胞的活性得到增强,尤其在机体免疫应答中,特别是在抗肿瘤免疫和抗病毒免疫中发挥着不可替代的作用。

青蒿素是一种提取自菊科植物黄花蒿的过氧桥结构的倍半萜,对多种疟疾有疗效,因其高效、安全、毒性低的优点逐渐被应用于临床医学,但是其存在半衰期短,口腔较低活性和较低的溶解度等缺点,化学家们重组了青蒿素以克服上述问题并获得了一系列的青蒿素衍生物,如DHA、蒿甲醚和青蒿琥酯DHA。作为一个青蒿素的衍生物,除了抗疟疾的效果还具有强大的抗癌作用,DHA对人体的肿瘤影响也很大,科学家们研究证明DHA能抑制肿瘤细胞活力。目前常用的肿瘤药物的耐药性仍然难以解决,而研究人员发现DHA可以逆转对化疗药物的耐药性或增强抗癌活性[8]。DHA能够抑制C6胶质瘤的生长,使G0/G1期癌变细胞受到阻滞,DHA能够抑制细胞生长水平且和凋亡相关[9];DHA还被证实能够通过调控AKT/p53/Bcl-2/Bax轴,下调miR-21基因抑制脑胶质瘤细胞中的增值、转移和侵袭能力,增强放射敏感性[10];而另一项实验中发现IL-10促进细胞生长和胶质瘤细胞的侵袭,并在该过程中KPNA2表达显著降低[11];以往的研究表明,IL-12可能诱发胶质瘤大脑中的排斥反应,CD8+T植入胶质瘤细胞产生排斥反应受到IL-12在中枢神经系统的结构性表达的影响[12]。以上实验均表明,IL-10和IL-12与脑胶质瘤的发生过程联系紧密,而脑胶质瘤发生过程总是伴随着炎性反应的发生,我们也证实了DHA介导着脑胶质瘤小鼠血清中IL-10和IL-12的表达。于是可以猜测,双氢青蒿素或许能够通过某条通路或轴调节IL-10和IL-12的表达影响脑胶质瘤,然而具体的信号通路和作用机制,还需要进一步的实验研究。

IL-10和IL-12显然介导着脑胶质瘤的生命过程,炎性反应与肿瘤生长是同步进行这一观点是被肿瘤学说普遍接受的[13]。IL-10是一种细胞因子,在许多类型的癌症中发挥双重功能,IL-10可促进抗药性肺癌细胞系的凋亡和转移,促进子宫颈癌的发病进展,IL-10的过表达与食管鳞状细胞癌也有联系,能够抑制肿瘤的生长以及调控黑色素瘤、结肠癌和纤维肉瘤的转移,胶质瘤中IL-10的产生明显会增加。IL-10刺激肿瘤相关巨噬细胞表达B7-H1,从而抑制免疫系统。在另一方面,在胶质瘤的影响下,小胶质细胞的释放包括IL-10在内的几类分子促进胶质瘤的生长。炎症活化是IL-10在人类胶质瘤进展中的表现方式,研究人员证实了随着脑胶质瘤的治疗,患者胶质瘤细胞生长和侵袭水平也连同IL-10表达水平一起改变[14]。本实验和之前一些研究者的研究结果都证明了这一点。IL-12同样是具有广泛生物学活性的细胞因子,主要由激活的炎性细胞产生。IL-12参与分泌间充质干细胞过程,这种细胞在肿瘤区域激活强免疫反应起到显著和持久的效果。IL-12不仅是免疫过程中重要因子,还可调节T细胞和NK细胞增殖、细胞毒性和淋巴因子产生,激活多种效应细胞,在抗肿瘤免疫和抗病毒免疫有着巨大的作用。有实验说明了IL-12具有激活巨噬细胞对付抗原缺失肿瘤细胞的杀伤力[15]。IL-12能够调控多种促血管生成基因(如IL-6、laminin-5、VEGF-C、VEGF-D)和炎性因子从而抑制血管形成和炎性反应异常进行,血管生成和炎性反应在脑胶质瘤发生过程中尤为重要,均说明血清中IL-10和IL-12表达水平在脑胶质瘤发生过程中的重要意义。

综上所述,双氢青蒿素对脑胶质瘤小鼠的IL-10、IL-12的表达水平是有明显的抑制效果,其诱导机制可能是双氢青蒿素通过某些信号通路来调控IL-10、IL-12的表达,进而影响脑胶质瘤发生过程中的炎性反应或免疫反应情况,达到对脑胶质瘤的缓解效果,但具体的作用机制仍需通过多种试验探讨。