电喷雾检测器高效液相色谱法测定复方北豆根氨酚那敏片中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙

沈心，顾晓风，周震宇

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏苏州 215104）

金银花与山银花均收载于2020年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)，其功效相似，均具有清热解毒、凉散风热的功能，是临床常用中药[1-2]。近来，含有金银花的中成药如连花清瘟胶囊和金花清感颗粒等在新冠肺炎治疗中发挥了积极作用[3]。由于金银花的市场价格远远高于山银花，在实际应用中存在着金银花与山银花药材混用的现象，部分商家为了牟取利益，可能在金银花药材及药物制剂投料中掺伪山银花[4-5]。有文献报道，二者化学成分含量存在显著差异，山银花中的绿原酸含量远高于金银花，绿原酸含量过高会引起过敏反应[6-8]，因此需要建立对应的检测方法以区分金银花和山银花，保障临床用药安全性。

复方北豆根氨酚那敏片为治疗普通感冒或流行性感冒的常见药，制剂处方由对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、咖啡因、北豆根提取物、金银花提取物和野菊花提取物组成。该药品现行标准为WS-10001-(HD-0352)—2002，但该标准尚未对其金银花提取物组分进行控制，按标准所得检验结果不能反映金银花投料的具体情况，无法对误用或掺杂山银花投料进行监督与控制，因此有必要建立专属的山银花检查方法，以有效控制制剂中金银花投料的规范性。

查阅相关研究文献和2020年版《中国药典》，通常选择灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙作为山银花的特征成分，以此区分山银花和金银花[2,9-10]。目前文献报道的灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙测定方法多采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法[5,9,11]和高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS)法[10,12]。ELSD 检测器对温度变化不敏感，用于梯度洗脱，重现性较差，而UPLC-MS 仪器昂贵，普及性不如液相色谱仪。电喷雾检测器对化合物的结构无特定要求，适用于梯度洗脱，灵敏度、稳定性和重现性均具有明显优势[13-14]。基于电喷雾检测器灵敏度高、重复性好、动态监测范围宽、操作简单、应用范围广、信号响应一致等优点，笔者建立了电喷雾检测器高效液相色谱法测定灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，以考察复方北豆根氨酚那敏片中是否存在使用山银花代替或掺杂金银花投料的现象。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Thermo ultimate 3000 型，配电喷雾检测器(CAD)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

电子天平：XS205DU 型，感量为0.1 mg，梅特勒托利多科技(中国)有限公司。

甲醇：色谱纯，霍尼韦尔贸易(上海)有限公司。

三氟乙酸：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。

复方北豆根氨酚那敏片样品：2 批，市售，批号分别为211111002和210404067。

灰毡毛忍冬皂苷乙对照品：纯度(质量分数)为96.1%，批号为111814-202106，中国食品药品检定研究院。

川续断皂苷乙对照品：纯度(质量分数)为96.8%，批号为111813-201804，中国食品药品检定研究院。

金银花对照药材：批号为121060-201608，中国食品药品检定研究院。

山银花(灰毡毛忍冬)对照药材：批号为121595-201202，中国食品药品检定研究院。

实验用水为超纯水，由密理博纯水仪制得。

1.2 色谱条件

色 谱 柱：Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国沃特世公司)；柱温：30 ℃；检测器温度：35 ℃；进样体积：20 μL；幂函数：1.0；采集频率：10 Hz；过滤常数：5.0；流动相：A 相为甲醇，B 相为0.05%三氟乙酸溶液，流量为1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution condition

1.3 溶液配制

1.3.1 对照品溶液

称取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品15.17 mg、川续断皂苷乙对照品15.62 mg，分别置于50 mL 容量瓶中，加入70%(体积分数，下同)甲醇溶液超声溶解，冷却至室温，用70%甲醇溶液稀释至标线，作为对照品储备液；精密量取对照品储备液适量混合，用70%甲醇溶液逐级稀释成系列浓度的混合对照品工作溶液。

1.3.2 样品溶液

取样品20片，研细混匀，称取细粉约1.0 g，精密称定，置于50 mL 容量瓶中，加入适量70%甲醇溶液，超声30 min溶解，放冷，用70%甲醇溶液稀释至标线，摇匀，用微孔滤膜(孔径0.45 μm)滤过。

1.3.3 阴性样品溶液

按复方北豆根氨酚那敏片处方，正常投料金银花提取物制备得阴性样品，按1.3.2方法配制阴性样品溶液。

1.3.4 限度溶液

按复方北豆根氨酚那敏片处方，掺入处方金银花投料质量分数5%的山银花(灰毡毛忍冬)投料，制得掺入5%山银花的复方北豆根氨酚那敏片样品，按1.3.2方法配制限度溶液。

1.4 实验方法

取灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙系列混合对照品溶液及样品溶液，按1.2色谱条件进样测定，记录色谱图峰面积，绘制标准工作曲线，采用标准曲线法计算样品中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量。

2 结果与讨论

2.1 样品提取溶剂和提取时间

样品处理选择操作简便的超声提取法，选择体积分数分别为50%、70%、100%的甲醇溶液作为提取溶剂，超声时间分别选择20、30、40 min 进行试验，考察样品(批号为210404067)中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的测定值，结果分别列于表2 和表3。由表2和表3数据可知，70%甲醇溶液超声提取30 min目标物测定值最高，说明该条件下目标物可充分提取，故提取溶剂选择70%甲醇溶液，超声提取时间为30 min。

表2 用不同体积分数的甲醇提取时样品的测定结果Tab.2 Different volume fractions methanol extracted results

表3 不同提取时间样品的测定结果Tab.3 Different times extracted results

2.2 目标物限量选择

根据《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则0212药材和饮片检定通则中规定，药屑杂质通常不得超过3%(质量分数)，同时考虑到山银花和金银花产地分布广泛，二者相似度高，金银花中易混入少量山银花，认为金银花中掺入质量分数为5%的山银花可忽略不计。以掺入5%山银花的自制复方北豆根氨酚那敏片样品的含量作为限量指标[15]。不同产地的山银花药材中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量各有不同[10]，试验制备的限度溶液中灰毡毛忍冬皂苷乙检出质量分数为0.33 mg/g，川续断皂苷乙检出质量分数低于该方法检出限，故选择方法检出限0.06 mg/g为川续断皂苷乙拟定限量，0.33 mg/g为灰毡毛忍冬皂苷乙拟定限量。

2.3 专属性试验

分别取阴性样品溶液、混合对照品溶液(灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙质量浓度分别为55.94、46.15 μg/mL)和样品溶液，按1.2 色谱条件测定，记录液相色谱图如图1所示。

图1 专属性试验色谱图Fig.1 Chromatograms of exclusive test

由图1 可以看出，灰毡毛忍冬皂苷乙峰和川续断皂苷乙峰以及相邻色谱峰均实现基线分离，理论板数均大于5 000，阴性样品中无相对应的色谱峰，其它组分无干扰，方法专属性良好。

2.4 线性方程、检出限及定量限

取系列混合对照品工作溶液，按1.2色谱条件进行测定，记录色谱峰面积响应值，以对照品溶液质量浓度的对数值(C)为横坐标，以色谱峰面积的对数值(A)为纵坐标，进行线性回归，计算线性方程和相关系数。另取混合对照品溶液(灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙质量浓度分别为11.66、12.10 μg/mL)，用70%甲醇溶液逐级稀释，同法测定，分别以3倍和10 倍信噪比对应的质量浓度作为各组分的检出限和定量限。

灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限列于表4。由表4可知，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的质量浓度分别在2.33～291.57、2.42～302.40 μg/mL范围内其对数值与峰面积对数值线性关系良好，检出限分别为1.17、1.21 μg/mL，定量限分别为2.33、2.42 μg/mL。

2.5 精密度试验

取批号为211111002的样品，平行制备6份样品溶液，按1.2色谱条件进行测定，结果列于表5。

表5 精密度试验结果Tab.5 Precision test results

由表5 可知，样品中灰毡毛忍冬皂苷乙的平均质量分数为2.68 mg/g，测定值的相对标准偏差为2.54%，川续断皂苷乙的平均质量分数为2.14 mg/g，测定值的相对标准偏差为0.66%，表明该方法精密度良好。

2.6 加标回收试验

取约0.5 g 样品(批号为211111002)，精密称定，共9 份，分别置于50 mL 容量瓶中，按低、中、高3 个浓度分别加入对照品溶液(灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙质量浓度分别为0.35、0.29 mg/mL) 2.0、4.0、6.0 mL，加入70%甲醇溶液适量，超声30 min溶解，放冷，用70%甲醇溶液稀释至标线，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液按1.2色谱条件进行测定，记录色谱峰面积并计算灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙的回收率，结果列于表6。由表6 可知，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的加标平均回收率分别为104.8%、101.5%，表明该方法准确度较高，可满足分析要求。

表6 样品加标回收试验结果Tab.6 Recovery test results

2.7 稳定性试验

取混合对照品溶液(灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙质量浓度分别为29.16、30.24 μg/mL)，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h，按1.2 色谱条件测定，结果显示，灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙的色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为2.77%、2.67%，表明该溶液室温放置24 h基本稳定。

3 结语

建立了电喷雾检测器高效液相色谱法测定复方北豆根氨酚那敏片中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙含量的分析方法，该方法操作简单，具有较好的精密度和准确度，能够有效判断复方北豆根氨酚那敏片中是否存在以山银花代替或是掺杂金银花投料的情况，弥补现行质量标准中的监测盲点，可有效控制金银花的投料规范性，为该类制剂的用药安全提供保障。