柱前衍生-高效液相色谱法测定鱼类中组胺

2024-02-20郭新颖

化学分析计量 2024年1期

郭新颖

（南通市疾病预防控制中心，江苏南通 226001）

组胺是由组氨酸在脱羧酶的作用下产生的一种有机含氮化合物。天然寄生的微生物菌会通过繁殖分泌出组胺酸脱羧酶，并与生物体内的组胺酸转化为组胺，因此组胺更易存在于蛋白质含量丰富的鱼类水产品中[1-2]。已有研究报道，金枪鱼、鲭鱼、秋刀鱼等鱼类及其制品是组胺含量较高的食品之一[3-4]。组胺不慎被人体摄入将引发健康风险，中毒症状轻者表现为恶心、呕吐、头痛、心悸、晕眩及出疹，重者会引发哮喘及突发心脏疾病[5-6]。目前一些国家已经规定了组胺的限量标准，如美国规定水产品及其制品中组胺含量不得超过50 mg/kg，欧盟规定食品中组胺含量不得超过100 mg/kg，中国规定鲐鱼中组胺含量不得超过1 000 mg/kg，其它海产鱼类中不超过300 mg/kg。我国是水产品养殖和进出口大国，水产品质量安全关系到国际贸易与人体健康，因此对水产品中的组胺进行定量检测极其重要。

目前，国内外关于鱼类等水产品中组胺的检测方法多采用高效液相色谱(HPLC)法[7-10]、高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法[11-14]等。其中，UPLC-MS/MS法仪器昂贵且对人员技术要求高，在一般基层检测机构中难以普及应用；而HPLC 法仪器价格适中，操作简便，分析快速，广泛应用于分析检测生物胺类化合物，成为测定组胺的常用方法之一。组胺的样品处理方法主要为固相萃取法[15-16]和柱前衍生法[17-18]。商品化固相萃取柱不仅价格高，还需要大量有机溶剂进行活化、淋洗、洗脱，过程繁琐，耗费人力物力；另外，鱼肉制品基质复杂，样品中组胺易分解，无法保证试剂衍生化效率，因此有必要开发简单易操作、可靠环保、衍生效率高的样品处理方法。

笔者建立了一种试剂衍生化效率高、衍生步骤简单的柱前衍生-高效液相色谱法，用于测定海鱼中的组胺含量，该方法可为水产品中组胺的含量检测及相关标准制定提供理论参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260型，带有紫外-可见检测器装置，美国安捷伦科技有限公司。

分析天平：AG245 型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司。离心机：Primo B型，美国赛默飞科技有限公司。组胺二盐酸盐标准品：纯度(质量分数)为99%，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1，7-二氨基庚烷、丹磺酰氯：质量分数分别大于98.0%和99.0%，上海安谱试剂有限公司。

乙腈：色谱纯，德国默克公司。

乙酸、盐酸、氨水、乙醚、正己烷、氢氧化钠、乙酸铵：均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

采用彩色多普勒超声诊断仪（型号：飞利浦CV350），选用线阵探头，频率为10～13MHz。指导患者采取仰卧位，将颈部暴露，垫高肩部，后仰头颈部，尽可能的偏向检测对侧。详细检查患者斑块大小、范围、明确斑块位置、内径、内膜、颈动脉血管走形、起点以及起源等。根据斑块的回声情况判断斑块的性质。以彩色多普勒技术显示出血流方向，判断有无充盈，血流信号有无逆转，以PW（脉冲多普勒）检查各节段血流频谱，测量PSV（收缩期峰值流速）、EDV（舒张期峰值流速）、Vm（平均流速）、RI（阻力指数）。局部狭窄的地方，需要测量该部位舒张末期最大峰值、收缩期最大峰值、狭窄处管腔内径，对狭窄程度进行全面评估。

海鱼样品：鲅鱼，市售。

1.2 标准溶液配制

组胺标准储备液：1 000 μg/mL，精确称取组胺二盐酸盐标准品0.016 6 g (折算为生物胺单体量0.010 0 g)，加入0.1 mol/L 盐酸溶液，溶解并定容至10 mL，混合均匀。

组胺标准使用液：100 μg/mL，吸取1.0 mL组胺标准储备液，加入0.1 mol/L 的盐酸，稀释并定容至10 mL，混合均匀。

内标标准储备液：10 μg/mL，精确称取1，7-二氨基庚烷0.100 g，加入0.1 mol/L 盐酸溶液，溶解并定容至10 mL，混合均匀。

内标标准使用液：200 μg/mL，准确吸取200 μL内标标准储备液，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释并定容至10 mL，混合均匀。

系列组胺标准工作溶液：分别移取组胺标准使用液10、25、50、100、150、250、500 μL，各加入250 μL 内标标准使用液，用0.1 mol/L 盐酸溶液定容至1.0 mL，得到质量浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 μg/mL 含内标的系列组胺标准工作溶液。

1.3 仪器工作条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；紫外检测波长：254 nm；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃；流动相：A 相为含0.1% (体积分数)乙酸的0.01 mol/L 乙酸铵溶液-乙腈(体积比为1∶9)，B相为含0.1% (体积分数)乙酸的0.01 mol/L乙酸铵溶液-乙腈(体积比为9∶1)，流量为0.8 mL/min；淋洗方式：梯度洗脱[19]。

1.4 样品处理

样品的提取和净化：参考GB 5009.208—2016《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》进行。

空白样品溶液：准确称取不含目标组分的空白样品基质，同法制备空白样品溶液。

1.5 测定方法

在1.3仪器工作条件下，对系列组胺标准工作溶液进行测定，以组胺标准工作溶液的质量浓度(x)为横坐标，以标准工作溶液的色谱峰面积响应值(y)为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。样品中的组胺采用色谱峰面积外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱选择

分别选择ZORBAX Eclipse XDB C18柱和Dikma Diamonsil C18柱两种C18色谱柱进行试验，结果发现，目标物色谱保留时间基本一致，且目标峰附近无干扰峰，色谱峰分离良好，峰形对称完整，说明在相同的测试条件下，选择通用型C18色谱柱均可满足测试要求，实验室可根据实际情况选择色谱柱。

2.2 衍生条件选择

2.2.1 衍生试剂

分别选择丹磺酰氯和苯磺酰氯对样品中的组胺进行衍生试验，结果发现，当使用丹磺酰氯衍生试剂时，组胺衍生物和内标物均能够正常出峰，且目标组分的线性良好，而苯磺酰氯衍生剂在相同使用剂量和测试条件下未能检出衍生产物，说明丹磺酰氯的衍生效果好，适于本方法组胺衍生，因此选择丹磺酰氯作为衍生试剂。

2.2.2 衍生温度

分别选择在25、30、40、50、55、60 ℃条件下进行衍生试验，空白加标样品中组胺的回收率列于表1。由表1 可知，当温度不高于50 ℃时，组胺的回收率极低，衍生效果差；当温度达到55 ℃时，组胺的回收率较高，衍生效果较好；当温度为60 ℃时，组胺的回收率为98.4%。说明低温不利于组胺盐与衍生试剂的衍生反应，最终将反应温度设定为60 ℃。

表1 不同衍生温度下加标样品中组胺的回收率Tab.1 Recoveries of histamine in spiked samples at different derivative temperatures

2.2.3 衍生反应时间

分别选择衍生反应时间为20、30、40、45、50、60 min 进行试验，空白加标样品中组胺的回收率列于表2。

表2 不同衍生反应时间时加标样品中组胺的回收率Tab.2 Recoveries of histamine in spiked samples at different derivative reaction times

由表2可知，当衍生反应时间大于40 min时，目标产物的回收率较高并趋于稳定；而当衍生时间小于40 min时，目标产物的回收率较低。说明适当延长衍生反应时间有利于衍生反应完全，衍生效果较好。考虑到时间成本，最终选择衍生反应时间为45 min。

2.3 色谱图

在1.3 仪器工作条件下，分别测定质量浓度为25.0 μg/mL 的组胺标准溶液、空白样品溶液和加标样品溶液，色谱图如图1～图3 所示。由图1～图3可以看出，组胺衍生物色谱保留时间为19.299 min，内标1，7-二氨基庚烷的色谱保留时间为23.263 min，两个色谱峰形尖锐、对称、分离度良好。在空白样品色谱图中对应保留时间位置未见组胺色谱峰，说明该方法专属性好。

图1 组胺标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of histamine standard solution

图2 空白样品溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of blank sample solution

图3 加标样品溶液色谱图Fig.3 Chromatogram of spiked sample solution

2.4 线性方程与检出限

将质量浓度为1.0～50.0 μg/mL 的组胺系列标准工作溶液在1.3仪器工作条件下依次进样测定，以标准工作溶液的质量浓度为横坐标，以不同组胺质量浓度下对应的色谱峰面积为纵坐标进行线性拟合，计算得到组胺标准工作曲线方程为y=187.1x+44.516，相关系数为0.999 7。表明该方法线性良好，能够满足实际样品的测定要求。

选择质量浓度为1.0 μg/mL 的组胺标准溶液，在1.3仪器工作条件下进行测定并记录信号强度，以将信噪比S/N分别为3和10时对应的组胺标准溶液的质量浓度换算为样品中组胺的质量分数，作为方法检出限和定量限，得到该方法的检出限为7.2 μg/kg，定量限为24 μg/kg。

2.5 加标回收与精密度试验

在鲅鱼样品中分别添加2.5、10.0、25.0 μg/mL三种质量浓度水平的组胺标准溶液进行加标回收试验。按照1.4样品处理方法衍生后进行定量测定，结果列于表3。由表3 可知，样品加标平均回收率为96.8%～99.2%，测定结果的相对标准偏差(RSD)为1.6%～3.7%(n=6)，表明该方法的准确度、精密度较高，满足实际样品的测定要求。