高效液相色谱法测定诃子中诃黎勒酸和诃子酸

2024-02-20王巍张强杨武杰郝季陈九妹安悦言鞠成国窦德强

化学分析计量 2024年1期

王巍，张强，杨武杰，郝季，陈九妹，安悦言，鞠成国，2，窦德强

［1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600； 2.国家中医药管理局中药炮制技术传承基地（辽宁），辽宁大连 116600］

诃子为使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)或绒毛诃子(T.chebula Retz.var.tomentella Kurt.)的干燥成熟果实，为《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》) 2020 年版一部收载。诃子味苦、酸、涩，性平，归肺、大肠经，具有涩肠止泻、敛肺止咳、降火利咽的功效[1]。诃子化学成分主要为鞣质类[2]，其中以诃黎勒酸、诃子酸含量较高[3-5]。国内外多项研究表明，诃黎勒酸、诃子酸具有良好的抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及降血糖的作用[6-9]。赵鹿等[2]从植物亲缘学及化学成分特有性、传统功效、药性、药动学、新临床用途和化学成分可测性等多个方面预测包括诃黎勒酸、诃子酸在内的4 个化学成分为诃子的质量标志物。《中国药典》中诃子的质量标准缺少含量测定的要求，这对诃子药材的质量控制造成了一定的缺憾。同时现有文献也未见对诃黎勒酸、诃子酸同时进行含量测定的报道，多是对其它鞣质类成分进行测定[10-11]。笔者建立了测定诃子药材中诃黎勒酸、诃子酸含量的高效液相色谱法，作为《中国药典》2020年版一部中诃子质量标准的补充。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-16型，日本岛津公司。

电子天平：FA1004B 型，感量为0.1 mg，上海精密科学仪器有限公司。

电子天平：METTLER AE240 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

医用超声波清洗器：KQ-250E 型，江苏昆山市超声仪器有限公司。

诃黎勒酸、诃子酸对照品：经HPLC法[12-13]检测，纯度(质量分数)不小于98%，自制。

乙腈：色谱纯，美国天地试剂公司。

甲醇、甲酸：均为色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

诃子药材：市售，产地为云南，经辽宁中医药大学药学院宋慧鹏副教授鉴定为使君子科植物诃子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果实。

实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Dikma Platisil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪科马科技有限公司)；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；流动相：体积分数为0.1%的甲酸水溶液-乙腈-甲醇(体积比为78∶16∶6)，等度洗脱，流量为1 mL/min；进样体积：5 μL。

1.3 溶液制备

混合对照品溶液：诃黎勒酸、诃子酸质量浓度分别为0.410、0.455 mg/mL。精密称取诃黎勒酸、诃子酸对照品适量，加入50%(体积分数，下同)乙腈溶液溶解，并稀释、定容。

样品溶液：取诃子药材，去核，留果肉，粉碎，过孔径为250 μm (65目)筛。精密称取0.1 g，精密加入50%乙腈溶液25 mL，称定质量，超声(功率250 W，频率40 kHz)提取30 min，冷却至室温，以提取溶剂补足损失质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容至标线，摇匀，再经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，作为样品溶液。

1.4 实验方法

取混合对照品溶液、样品溶液，按照1.2 色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，按照外标法计算诃子药材中诃黎勒酸、诃子酸的含量。

2 结果与讨论

2.1 提取方式选择

取诃子药材，去核，留果肉，粉碎，过孔径为250 μm 筛。精密称取2 份，每份0.1 g，精密加入50%乙腈溶液25 mL，称定质量，分别超声(功率250 W，频率40 kHz)提取30 min、加热回流30 min；放冷，以提取溶剂补足损失质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容至标线，摇匀，再经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液进行测定。超声提取样品测得诃黎勒酸质量分数为13.95%，诃子酸质量分数为9.30%；加热回流30 min提取样品测得诃黎勒酸质量分数为13.27%，诃子酸质量分数为9.15%。说明超声提取效果更佳，因此提取方式应以超声提取为宜。

2.2 提取溶剂选择

取诃子药材，去核，留果肉，粉碎，过孔径为250 μm 筛。精密称取21 份，每份0.1 g，分别精密加入25 mL 的水、不同浓度的甲醇溶液或不同浓度的乙腈溶液，其余步骤同上，结果见表1。

表1 不同提取溶剂时诃黎勒酸和诃子酸质量分数测定结果Tab.1 Determination results of mass fractions of chebulagic acid and chebulinic acid in different extraction solvents %

由表1可知，乙腈的提取率高于甲醇，其中50%乙腈溶液对两种成分的提取量均较高，因此提取溶剂选择50%乙腈溶液。文献[14-15]对诃子化学成分分析均采用70%甲醇溶液作为提取溶剂，笔者在制备诃黎勒酸、诃子酸对照品时发现，两者在甲醇中不稳定，会与溶剂发生可逆的络合反应，因此采用甲醇为溶剂进行提取对含量测定结果影响较大。

2.3 色谱条件优化

2.3.1 检测波长

分别对诃黎勒酸、诃子酸对照品进行200～400 nm 吸收光谱扫描，结果表明，诃黎勒酸最大吸收波长为278 nm，诃子酸最大吸收波长为280 nm，最终检测波长确定为280 nm。

2.3.2 流动相

由于样品提取试剂为乙腈，首先选择乙腈-水作为淋洗液，发现在不同配比条件下1，2，3，4，6-O-五没食子酰基葡萄糖与诃子酸均无法分离，表明1，2，3，4，6-O-五没食子酰基葡萄糖与诃子酸在乙腈中选择性相似，色谱行为相近。在洗脱体系中加入少量甲醇，结果表明，随着甲醇加入量的增加，两者的分离度逐渐增大，当甲醇体积分数为6%时，两者可以达到完全分离，且诃黎勒酸与诃子酸在24 h内稳定性良好，故最终选择以水-乙腈-甲醇三相组成淋洗液。

取诃子药材，按1.3 方法制备样品溶液，对淋洗液组成进行优化，考察两种目标成分的色谱分离效果，两种目标成分保留时间、色谱分离度、理论塔板数及拖尾因子结果见表2。由表2可知，当选择序号为1、3、5的流动相时，诃黎勒酸、诃子酸的分离度较小；选择序号为4的流动相时，诃子酸的保留时间过长；选择序号为7 的流动相时，拖尾因子变大；序号为6 的流动相中增加了甲酸体积分数，但对整体色谱行为影响不大。综合考虑，序号为2 的流动相效果最佳，故流动相选择0.1%的甲酸水溶液-乙腈-甲醇(体积比为78∶16∶6)。

表2 不同流动相组成时诃黎勒酸、诃子酸的色谱分离效果Tab.2 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid under different mobile phase compositions

2.3.3 淋洗液流量

取诃子药材，按1.3方法制备样品溶液，分别选择不同淋洗液流量进行试验，考察两种目标成分的色谱分离效果，两种目标成分保留时间、色谱分离度、理论塔板数及拖尾因子结果见表3。由表3可知，淋洗液流量大于1.0 mL/min时，诃黎勒酸分离度低于2.0；当淋洗液流量小于1.0 mL/min时，诃子酸的保留时间过长。综合考虑，淋洗液流量选择1.0 mL/min。

表3 不同淋洗液流量时诃黎勒酸、诃子酸的色谱分离效果Tab.3 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid at different flow rates of eluent

2.3.4 进样体积

取诃子药材，按1.3 方法制备样品溶液，分别选择不同进样体积进行试验，考察两种目标成分的色谱分离效果，两种目标成分色谱分离度、理论塔板数及拖尾因子结果见表4。由表4可知，当进样体积不大于5 μL 时，诃黎勒酸、诃子酸的分离度均大于1.5；理论塔板数均大于8 000，拖尾因子均小于1.2；但进样体积为3 μL 太小，误差较大；当进样体积为10 μL 时，理论塔板数显著降低；当进样体积为20 μL 时，诃黎勒酸与诃子酸前延峰拖尾现象严重，不能满足定量分析要求。综合考虑，选择进样体积为5 μL。

表4 不同进样体积时诃黎勒酸、诃子酸的色谱分离效果Tab.4 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid at different injection volumes

2.3.5 柱温

取诃子药材，按1.3 方法制备样品溶液，分别选择不同柱温进行试验，考察两种目标成分的色谱分离效果，两种目标成分保留时间、色谱分离度、理论塔板数及拖尾因子结果见表5。由表5可知，在30～40 ℃范围内随着柱温的升高，诃黎勒酸、诃子酸保留时间逐渐减小，其它指标无明显变化，为减少仪器运行的损耗，选择柱温为30 ℃。

表5 不同柱温时诃黎勒酸、诃子酸的色谱分离效果Tab.5 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid at different column temperatures

2.4 系统适用性试验

取对照品溶液、样品溶液分别按1.2色谱条件进样测定，结果如图1所示。由图1可以看出，在样品溶液和对照品溶液的色谱图中诃黎勒酸、诃子酸色谱峰保留时间一致，且实现基线分离。诃黎勒酸保留时间为13.507，分离度为2.2，理论塔板数为8 860，拖尾因子为1.16；诃子酸保留时间为33.711，分离度为3.2，理论塔板数为11 087，拖尾因子为1.20。

图1 诃黎勒酸、诃子酸混合对照品溶液、诃子样品溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed reference solutionof chebulagic acid and chebulinic acidand sample solution of Terminalia Chebula Retz.

2.5 线性方程、检出限与定量限

取混合对照品溶液，以50%乙腈溶液逐级稀释成诃黎勒酸质量浓度分别为0.205 0、0.102 5、0.051 3、0.025 6、0.012 8、0.006 4 mg/mL，诃子酸质量浓度分别为0.227 5、0.113 8、0.056 9、0.028 4、0.014 2、0.007 1 mg/mL 的系列混合对照品工作溶液。按1.2 色谱条件分别进样测定，以目标物质量(μg)为横坐标，对应色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归，计算得诃黎勒酸的线性方程为y=1 591 948x-25 820，相关系数为0.999 6；诃子酸的线性方程为y=2 267 031x-61 935，相关系数为0.999 5。表明诃黎勒酸、诃子酸的质量分别在0.032 03～1.025 μg、0.035 55～1.137 μg 范围内与色谱峰面积线性关系良好。

将质量浓度最低点的混合对照品溶液以50%乙腈溶液逐级稀释，分别进样检测，以信噪比为3∶1时对应的溶液中目标物的质量为方法检出限，以信噪比为10∶1 时对应的溶液中目标物的质量为定量限。诃黎勒酸的检出限为2.67 ng，定量限为8.00 ng；诃子酸的检出限为4.44 ng，定量限为11.85 ng。

2.6 精密度试验

取诃子药材，按1.3 方法平行制备6 份样品溶液，按1.2色谱条件分别进样测定，计算诃黎勒酸和诃子酸的质量分数及相对标准偏差，结果列于表6。由表6可知，诃黎勒酸平均质量分数为97.9 mg/g，相对标准偏差为1.8%；诃子酸平均质量分数为83.9 mg/g，相对标准偏差为1.8%。表明该方法精密度良好。

表6 精密度试验结果Tab.6 Results of precision test

2.7 加标回收试验

取诃子药材样品粉末，按照所建方法测定诃黎勒酸、诃子酸含量，然后取约0.05 g样品，共9份，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入相当于药材中目标物含量约80%、100%和120%的诃黎勒酸、诃子酸对照品，每个剂量3 份，按1.3 方法制备样品溶液，按1.2色谱条件进样测定，计算两种目标成分的回收率，结果列于表7。由表7可知，诃黎勒酸、诃子酸的回收率均在97%～103%之间，表明方法准确度良好。