30%丙硫菌唑·氟环唑悬浮剂的高效液相色谱分析方法研究

苑璐，董立峰，于金山，韩顺英，辛秀亮

(1.山东碧奥生物科技有限公司，山东威海264402；2.山东省五莲县叩官镇农业综合服务中心，山东日照262300；3.日照市农业综合执法支队，山东日照262300)

丙硫菌唑(prothioconazole)是由拜耳公司研发的一种低毒、广谱的新型三唑硫酮类杀菌剂，主要用于防治禾谷类作物、豆类作物等的多种病害，尤其是对谷物作物的真菌病害表现出优异的防治效果及优良的保绿防衰作用，且增产明显[1-3]。氟环唑(epoxiconazole)是一种内吸性三唑类杀菌剂，其主要抑制病菌麦角甾醇的合成，阻碍病菌细胞壁的形成，且对真菌C14-脱甲基化酶(C14-demethylase)有显著抑制作用[1,4]，同时可提升作物几丁质酶活性，使真菌吸器收缩，抑制真菌侵入。为了提高对作物病害的防治效果，延缓抗药性的产生，生产实际中常将这2 种药剂混合使用或加工成混剂。2 者混剂的HPLC 检测方法未见报道，笔者在30%丙硫菌唑·氟环唑悬浮剂的研制及其应用的基础上，开展了产品分析方法研究，所得方法具有高效、快速、准确等优点，可为其生产及质量控制提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

甲醇，色谱纯(市售)；磷酸，分析纯(市售)；丙硫菌唑标样，已知质量分数98%(安徽久易农业股份有限公司)；氟环唑标样，已知质量分数98%(沈阳科创化学品有限公司)；30%丙硫菌唑·氟环唑悬浮剂样品(实验室自制)。

PM1000 高效液相色谱仪配紫外检测器(具可调波长)；ME204E/02 电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；KQ2200DA 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；滤膜：0.45µm(有机系，天津市领航实验设备股份有限公司)。

1.2 色谱条件

Agilent 5TC-C18不锈钢柱色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.，内装5µm 填充物)；流动相：甲醇-pH 3.0 磷酸水溶液(体积比80∶20)，通过滤膜过滤并进行脱气；流速为1.0 mL/min；检测波长为220 nm；柱温为室温；进样体积为5µL。在该色谱条件下，丙硫菌唑和氟环唑的保留时间分别约为8.00、6.00 min。丙硫菌唑和氟环唑标样、混剂试样的高效液相色谱图见图1。

图1 丙硫菌唑和氟环唑标样、混剂试样的高效液相色谱图

1.3 方法

1.3.1 标样溶液的配制

分别称取0.05 g(精确至0.00001 g)丙硫菌唑和氟环唑的标准品于100 mL 容量瓶中，加入适量的甲醇，超声均匀、冷却至室温后用甲醇稀释到刻度线，摇匀备用。

1.3.2 试样溶液的制备

称取约0.35 g (精确至0.00001 g) 30%丙硫菌唑·氟环唑悬浮剂于100 mL 容量瓶中，加入适量的甲醇，超声均匀、冷却至室温后用甲醇稀释到刻度线，摇匀备用。

1.4 测定

按1.2 条件，仪器基线确认稳定后，使用标样溶液连续进样，待相邻2 针峰面积相对变化＜2.0%，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

1.5 计算

将测得的2针试样溶液以及试样前后2针标样溶液中丙硫菌唑和氟环唑的峰面积分别进行平均。试样中的丙硫菌唑、氟环唑的质量分数按下式计算[4-5]：

式中：w为试样中丙硫菌唑或氟环唑的质量分数(%)；R2为丙硫菌唑或氟环唑试样的峰面积平均值；m1为丙硫菌唑或氟环唑标样的质量(g)；w1为标样中丙硫菌唑或氟环唑的质量分数(%)；R1为标样溶液中丙硫菌唑或氟环唑的峰面积平均值；m2为试样的质量(g)。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

通过多次检测确认并充分考虑非有效成分峰的干扰，确定了220 nm 为该方法的检测波长，并且在该波长下，2 种有效成分都有较好的峰形。

2.2 流动相及色谱柱的选择

比较了不同厂商、填料的色谱柱和不同流动相体系，最终确认以甲醇-pH 3.0 磷酸水为流动相，可以使丙硫菌唑、氟环唑有效成分以及其他非有效组分得到有效地分离，且不存在其他干扰因素。为了得到良好峰形和分析效果，最终设定流动相体积比为80∶20，柱温为室温，流速为1.0 mL/min。

2.3 线性相关性测定

准确称取5 个不同质量的丙硫菌唑、氟环唑标样，分别配制5 个系列质量浓度的标样溶液。按照确定的色谱分析条件进样，得到其各自峰面积响应值与其质量浓度的关系。在质量浓度300～708 mg/L 范围内，丙硫菌唑质量浓度与峰面积响应值呈现良好的线性关系，其线性方程为y=990 444x+2E+06，相关系数R2=0.9999；在质量浓度295～703 mg/L 范围内，氟环唑质量浓度与峰面积响应值呈现良好的线性关系，其线性方程为y=1E+06x-166 968，相关系数R2=0.9996。

2.4 方法的精密度

准确称取同一批次30%丙硫菌唑·氟环唑悬浮剂试样6 份，在上述的色谱条件下，测定试样中氟环唑、丙硫菌唑的质量分数(表1)。丙硫菌唑和氟环唑的标准偏差均为0.02，变异系数分别为0.1%、0.2%。该方法的精密度良好，能满足对30%丙硫菌唑·氟环唑悬浮剂的定量分析。

表1 精密度测定

2.5 方法的准确度

在已知含量的30%丙硫菌唑·氟环唑悬浮剂样品溶液中，定量加入氟环唑、丙硫菌唑标样，按上述的色谱条件进行分析，结果见表2。丙硫菌唑的平均回收率为99.76%；氟环唑的平均回收率为99.90%，说明该方法准确度良好。

表2 准确度测定

2.6 非分析物干扰试验

用不含有效成分的标准制剂作为空白样品，按1.2 色谱操作条件进行分析，采用高倍进样，结果未见空白样品中含其他干扰物质。

3 结论

本文建立了一种同时检测30%丙硫菌唑·氟环唑悬浮剂中有效成分的定性定量高效液相色谱分析方法，即采用5TC-C18色谱柱(150mm×4.6mmi.d.×5µm)、辅助可变波长紫外检测器，设定甲醇-pH3.0 磷酸水溶液为流动相(体积比为80∶20)。该方法操作简单快捷、重复性和准确度高、分离效果好，可用于30%丙硫菌唑·氟环唑悬浮剂产品的质量控制。