欧盟微生物农药登记中次生代谢产物的风险评估

申继忠，张海燕，余武秀

(1.上海艾农国际贸易有限公司，上海200122；2.江苏永安化工有限公司，江苏涟水223404)

1 微生物的次生代谢和次生代谢产物

代谢是生命体赖以生存的重要生命活动。代谢是指生物体内所发生的用于维持生命的一系列有序的化学反应的总称。这些反应使得生物体能够生长和繁殖、保持它们的结构以及对外界环境做出反应。代谢的实质是生命体内部及其与外界环境之间进行的物质和能量交换。因此可以将代谢分如下几类：分解代谢(对大的分子进行分解以获得能量，如细胞呼吸)，合成代谢(利用能量来合成细胞中的各个组分，如蛋白质和核酸等)，物质代谢(指生物体与外界环境之间物质的交换和生物体内物质的转变过程)，能量代谢(指生物体与外界环境之间能量的交换和生物体内能量的转变过程)。

另外，根据代谢产物对于生命体的意义还可以将代谢区分为初级代谢和次生代谢。初级代谢的代谢系统、代谢途径和代谢产物在各类生物中都基本相同，是一类普遍存在于各类微生物中的一种基本代谢类型。初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。在不同种类的微生物细胞中，初级代谢产物的种类基本相同。此外，初级代谢产物的合成在不停的进行着，任何一种产物的合成发生障碍都会影响微生物正常的生命活动，甚至导致死亡。

次生代谢的概念最早于1891 年由Kossel 明确提出。一般指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物生命活动无生理功能的物质，这一过程被称为次生代谢，所形成的产物为次生代谢产物。次生代谢产物多是分子结构较复杂的化合物，如抗微生物药物、毒素、生物碱等。

次生代谢在植物和微生物中都有发生，并且代谢途径和代谢产物因不同生物而异，就是同种生物也会由于培养条件不同而产生不同的次生代谢产物。在次生代谢产物中，对维持生命占有重要地位的并不少，但另一方面，各种动植物和微生物所大量积累的生物碱、类萜(ferpenoid)、酚类、抗菌物质、色素等，其生理意义并不完全清楚。

在微生物的新陈代谢中，一般将微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程称为初级代谢。初级代谢产物有单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等单体以及由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等生命必需物质。

微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂而且对微生物本身无明显生理功能或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质，如抗微生物药物、毒素、激素、色素等属于微生物的次生代谢产物。不同种类的微生物所产生的次生代谢产物不相同，它们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。

微生物作为自然界种群数量最为庞大的一类生命体，与人类的生产和生活关系极为密切，因此对微生物的生命过程和代谢研究发展迅速。

Xu 等[1]统计发现，植物内生真菌可以产生各种次生代谢产物。这些代谢产物分布在30 个不同属的各种真菌中，包括一些罕见的菌种。其中，球毛壳(Chaetomium globosum)是一种很特殊的微生物，因为它能产生大量独特的、结构上具有重要生物活性的球毛壳菌素(chaetoglobosins)。这些代谢产物对植物病原真菌的抗真菌活性表明，内生真菌可以通过产生对植物病原有毒甚至致命的生物活性分子来保护其宿主植物，并突显了内生真菌在产生有价值的代谢产物方面的潜力(表1)。

表1 不同微生物产生的抗真菌次生代谢产物数量[1]

微生物次生代谢产物也具有广泛的生物活性，而且很多次生代谢产物同时具有多种活性。有些产物具有农药活性，可用于多种作物保护目的(表2)[2]。

表2 各种微生物及其代谢产物的农药作用示例[2]

2 欧盟微生物农药登记的法规修订

微生物农药深受全球各国农药主管部门的关注。不同国家均采取尽可能有利于快速进入市场的登记审批制度。微生物农药的活性成分主要有微生物活体和/或其次生代谢产物。微生物活体的登记审批一般不存在太多争议，但各国对次生代谢产物的登记则有不同的措施和要求。美国对活体微生物和次生代谢产物均采取比较宽松的政策，如含有多种次生代谢活性物质的Majestene(灭活的发酵液)被批准作为杀线虫剂[3]。我国也批准登记了各种微生物次生代谢产物作为农药使用，如井冈霉素、武夷菌素等[4]。澳大利亚生物农药登记要求明确指出：如果微生物体产生或被怀疑可能产生毒素或有毒代谢物，则必须对代谢物进行鉴定，并在可能的情况下进行分离。毒素或有毒代谢物可能被要求提交完整的代谢和动力学研究结果。一些发展中国家如越南，则没有明确提出与代谢物有关的要求。

欧盟一直重视化学农药有效成分的环境代谢产物和微生物代谢产物的风险评估。有多种农药有效成分因为代谢产物的风险不被接受而遭到欧盟的禁用。为了区别对待化学农药和微生物农药，并尽可能减少对微生物代谢产物风险评估的要求，以促进微生物农药快速上市，2022 年欧盟批准了新的与微生物农药登记相关的法规。

欧盟微生物农药包括基于细菌、真菌、病毒和原生动物等生产的产品(主要指活体微生物产品)。2022 年2 月8 日欧盟成员国批准了4 项实施法规(Implementing Regulations)，修订了适用于微生物的现行法规。新的法规与欧洲绿色协议(European Green Deal)完全配合，并有助于实现从农场到餐桌战略(Farm to Fork strategy)的目标。4 项新法规包括：微生物有效成分的审批标准[Commission Regulation (EU) 2022/1438][5]、微生物活性物质登记审批需要提交的信息和数据要求[Commission Regulation (EU) 2022/1439][6]、微生物农药制剂产品登记所需提交的信息和数据要求[Commission Regulation (EU) 2022/1440][7]以及评价和授权含微生物生物制剂产品的统一原则[Commission Regulation(EU)2022/1441][8]。

这些新法规将促进微生物农药进入市场。

2022 年的修订，表现在以下几个方面：⑴允许使用同行评审的文献数据作为登记资料的部分内容。⑵更新了风险评价规则。⑶为微生物修订了“低风险农药”的定义。⑷清楚地定义了“抗微生物药物耐药性”等几个概念。⑸在新的“统一评估原则”中明确给出“受关切代谢产物”(metabolites of concern)的定义，不再提相关代谢产物(relevant metabolite)一词(但该词仍适用于化学农药)。旧的原则中只有“相关代谢产物”(适用于化学农药和微生物农药)的概念但是没有给出准确定义。⑹“受关切代谢产物”的定义：是指被评估微生物产生的次生代谢产物，具有已知的毒性或已知的相关抗微生物药物活性，其在微生物制剂(MPCA)中存在的浓度可能对人类健康、动物健康或环境构成风险，和/或无法充分证明代谢产物的原位生产与风险评估无关。

修订后的欧盟微生物农药登记法规对微生物次生代谢产物作出如下说明：⑴如果申请者声称其所生产的微生物农药中存在的一种或多种次生代谢产物是产品发挥植物保护作用的有效成分的一部分，则这些代谢产物的含量应按照化学农药登记要求的新规定予以声明。⑵申请人应确定并列出微生物可能产生的受关切的次生代谢产物，并根据登记要求的相关规定(有效成分审批资料要求的某些内容)提交用于确定或排除受关切代谢产物的信息摘要，除非该微生物是病毒。⑶如果有效物质属于以下2 类，则将其归为化学农药有效成分进行审批：化学物质(包括信息化合物和从生物材料中提取的物质)，或由微生物产生的次生代谢产物(包括从微生物中纯化的代谢产物或者从能复制或转移遗传物质的产生菌中提纯的代谢产物)。⑷除非另有说明，有关(潜在)代谢产物的数据要求适用于生物防治剂母药(TG-MPCA)或制剂产品(MPCP)中存在的代谢产物以及使用后原位产生的代谢产物。

3 修订后的法规对受关切次生代谢产物的信息要求

3.1 欧盟微生物农药统一评审原则对受关切代谢产物的评审要求

在统一评审原则的各条款下均对受关切次生代谢产物的信息提出了相应的要求：⑴评价受关切代谢产物的身份信息和质量标准。⑵根据活性成分审批要求法规Regulation(EU) No 283/2013 中要求的信息评价受关切代谢产物在储藏过程中发生的变化。⑶受关切代谢产物对植物的药害评价。⑷对受关切代谢产物分析方法的评价、残留分析方法评价。⑸评价受关切代谢产物的毒性；观察到的或预期的由于受关切代谢产物引起的植物保护产品的不良毒理学影响(对操作者、工人、旁观者和居民)；代谢产物残留引起的风险；代谢产物残留水平。

3.2 活性成分审批需要提交的受关切代谢产物的信息

⑴相关杂质的身份和定量信息(最高含量)。⑵对靶标生物的作用方式和寄主范围：应提供来自科学同行评审文献或任何其他可靠来源的关于受关切代谢产物可能的作用方式和目标生物可能暴露于受关切代谢产物的途径的信息。⑶有关代谢产物的信息：申请人应在这一项下确定并列出微生物产生的受关切代谢产物，包括根据活性成分数据要求的某些方面的要求提交的用于确定或排除受关切代谢产物的信息摘要，除非该微生物是病毒。可根据科学文献或对微生物或密切相关菌株进行的毒性、生态毒性或抗微生物药物活性研究的观察来确定受关切代谢产物。通过采用适当的基因组方法(如全基因组测序)证明，不存在生产所鉴定的潜在问题代谢产物所需的基因，应被视为证明该代谢产物不存在此类危害的证据。⑷受关切代谢产物分析方法。⑸受关切代谢产物残留分析方法。⑹治疗和急救措施：提交受关切代谢产物的已知拮抗剂(解毒剂)信息。⑺医学监测报告应包括受关切代谢产物信息。⑻代谢产物信息和毒性研究。⑼代谢产物残留数据。⑽微生物以及受关切代谢产物的环境发生、环境行为和归宿，代谢产物的环境暴露数据。⑾代谢产物的信息和生态毒理学研究[4]。

3.3 制剂登记需要提交的受关切代谢产物的信息

⑴制剂产品的物理、化学和技术特性。⑵储存前后受关切代谢产物的存在。⑶关于制剂产品的进一步信息：使用设备的清洗。⑷分析方法：受关切代谢产物的标样(技术上可行的话)和分析方法。⑸药效数据：受关切代谢产物对后茬作物的影响。⑹对人的影响：潜在毒性评价，包括皮肤致敏性、额外毒性数据。⑺对非靶标生物的影响：对陆栖脊椎动物、鱼、水生无脊椎动物、藻类、水生植物(大型水藻)、蜜蜂及其他非靶标节肢动物的影响，对土壤中非靶标中、大型生物的影响，对非靶标陆生植物的影响[5]。

4 微生物次生代谢产物的风险评价

2020 年，欧盟健康和食品安全总理事会颁布了用作农药的微生物产生的次生代谢产物的风险评价指南[9]。指南的目的是帮助评审人员对微生物农药制剂中存在的次生代谢产物进行风险评价，确定出可能受关切的次生代谢产物并进行相应的风险评估。通过定性定量风险评估确定受关切次生代谢产物的风险是否可被接受。

4.1 指南对微生物(受关切)次生代谢产物的定义

次生代谢产物对微生物的初级代谢过程并不是必需的，它表现出一些可能与微生物生存功能有关的生物活动，如竞争、寄生或共生、金属运输等。

次生代谢产物通常是在特定的物理和生物条件共同存在的情况下由微生物产生的。单个微生物菌株产生令人关切的代谢产物的能力取决于该特定菌株许多特有的环境和遗传因素。一种或多种菌株不产生不受欢迎的化合物并不能推定同一种内所有菌株也不产生这类化合物。

受关切次生代谢产物是被评估菌株产生的具有已知的毒性或抗微生物药物活性的代谢产物，其可接受的风险应通过定量风险评估来证明。

4.2 关于原位(in situ)产生的未知代谢产物

所谓原位产生的代谢产物，是指活体微生物制剂使用之后其在田间使用部位可能产生的代谢产物。指南文件中描述的方法是基于次生代谢产物的毒性研究、作用方式、对收获后的发酵培养基以及对微生物有害生物防治剂母药(TG-MPCA)和/或微生物防治剂(MPCP)的分析数据。不是在发酵过程中产生的代谢产物和/或与作用方式无关的原位产生的代谢产物的风险评价不在本指南的范围内。由于这些代谢产物是未知的，所以它们在天然微生物中的存在无法被合理地证实。可以预期，它们的产量很低，因为存在竞争而且微生物可利用的资源和能量都有限。此外，微生物被认为无处不在，因此人类、动物和环境都会自然接触到这些代谢产物。所以，除非通过公开文献综述、毒性研究、基因组表征或其他与微生物有关的信息能够确定这些代谢产物危害，否则可以合理地假设这些未知代谢产物不会构成可预见的风险，因此不构成法规意义上的“相关代谢产物(relevant metabolites)”。

4.3 关于具抗微生物药物活性的次生代谢产物

指南文件涉及的与微生物代谢产物有关的2 种危害是毒性和抗微生物药物活性。欧盟特别关注抗微生物药物的农业应用。因此，如果已知某种微生物能够产生具有重要医学意义的抗微生物药物(依据WHO的定义)，则应评估制剂产品中是否存在这类化合物。

WHO 对抗微生物药物(antimicrobials)耐药性(AMR)的释义如下：抗微生物药物包括抗生素、抗病毒药、抗真菌药和抗寄生虫药，它们是用于预防和治疗人类、动物和植物感染的药物。而抗微生物药物耐药性是指当细菌、病毒、真菌和寄生虫随着时间的推移发生变化，不再对药物产生反应。

与在制剂产品中存在的抗微生物药物的释放不同，土著或施用后的外来微生物原位产生的抗微生物药物只在很小的范围内产生一定时期的拮抗作用。即使土壤或植物环境中存在人类或动物病原体，暴露于这些抗微生物药物而直接相互作用，这种暴露也仅限于短时间，之后是长时间的不暴露。这种情况不利于抗微生物药物耐药性的发展和持续。因此，用于植物保护产品的微生物原位产生的抗微生物药物不被视为对人类和动物健康构成可预见的风险。因此，没有必要对这些原位产生的抗微生物药物化合物进行评估。

为了便于风险评价，指南文件给出了2 个定义，可视为评估原则。

⑴潜在受关切的代谢产物：被评估菌株可能产生的在基于文献和试验数据的初步评估中(即在该指南中描述的评估的第2 阶段结束时)已经确定具有毒性或抗微生物药物活性的代谢物。对此类次生代谢产物进一步的评估是必要的，以确定其是否属于受关切的次生代谢产物。

⑵受关切的代次生谢产物：被评估菌株产生的代谢物，具有已知的毒性或抗微生物药物活性，其可接受的风险应通过定量风险评估来证明。

4.4 分步确定受关切的次生代谢产物

为了确定微生物是否正在产生受关切的代谢产物，指导文件按照分步的程序进行评估。该指南将评估程序分成4 个阶段：⑴第1 阶段(步骤1～2)：确定需要评估的代谢产物所属类型(包括归入化学农药评审、无需进行评审的病毒、需要进一步评审3 种)；⑵第2 阶段(步骤3～11)：收集关于代谢产物的基本信息，并产生潜在受关切代谢产物的清单；⑶第3 阶段(步骤12～15)：确定哪些已识别的代谢产物值得关切，从而得到值得受关切的代谢产物清单和无需关切的代谢物清单；⑷第4 阶段(步骤16～20)：对受关切的代谢产物进行风险评估。

每个阶段由几个步骤组成。这些步骤包含对申请人和风险评估人员的提问，以指导他们完成每个阶段的过程。

4.4.1 第1 阶段(步骤1～2)：确定代谢产物所需的评估类型

步骤1：确定次生代谢产物在微生物农药作用方式中所起的作用。即需要确定微生物活性物质的主要作用方式是否基于制剂产品中存在的次生代谢产物。

关于微生物作用方式的信息对于识别潜在受关切代谢产物很重要。因此，在技术上可行的情况下必须在登记申请档案中尽可能详细地描述产品的作用方式，并有科学证据支持，以确定所鉴定的代谢产物是否明确参与作用方式。

如果微生物产品的植物保护作用已知是由于毒素/代谢产物的残留效应，或者作用方式是基于产品中存在的代谢物的残留效应，这意味着采用离体的代谢产物将产生相同的植物保护作用并且代谢物可以被视为活性物质，此时需要按照化学农药登记要求提交数据档案。含有灭活微生物及微生物代谢物的某些产品就属于这一类(如美国批准的Majestene 杀线虫剂)。

作用方式不是基于产品中存在的次生代谢物的所有微生物产品，则进入步骤2 进一步予以评估。

步骤2：目的是排除次生代谢产物的产生。如果微生物农药是基于病毒生产的，根据目前的科学知识，没有迹象表明病毒能产生可能令人担忧的代谢物，因此不需要进一步评估。

对于所有其他微生物：进入第2 阶段。

4.4.2 第2 阶段(步骤3～11)：收集关于代谢物的基本信息

在第2 阶段，结合不同来源的数据集，确定哪些代谢产物可能是由被评估的菌株和密切相关的菌株所产生，并收集有关这些代谢物的危害信息(即毒性或抗微生物药物活性)，以确定导致任何观察到的毒性作用的任何代谢物。

作为第2 阶段评估的一部分，需分别准备如下3 个清单：⑴所申请菌株及其相关菌株(及其危害作用)被确定的代谢物清单。⑵(生态)毒理学研究中观察到的可能由代谢物引起的有害影响清单。⑶未观察到任何有害影响的(生态)毒理学研究。

在这些(生态)毒理学研究中观察到的能产生有害影响的任何代谢物都必须予以鉴定。

应该对第一个清单中所有得到确定的代谢物进行单独的文献检索。然后将上述前2 个清单合并为潜在的受关切有毒代谢物清单(包括有抗微生物药物活性的化合物)。

收集关于代谢产物的基本信息，并生成潜在受关切代谢产物的清单。

在第2 阶段，步骤3～8 是强制性的。步骤9 是一个可选步骤，可用于排除潜在的代谢产物，以进一步评估。步骤10 是有条件的步骤，对于信息不太全的微生物是必需的。

4.4.3 第3 阶段(步骤12～15)：确定受关切的代谢产物

在第3 阶段将处理由第2 阶段确定的潜在受关切代谢物可能引起的风险。

预期的成果是将潜在受关切的代谢产物区分为“不受关切”或“受关切并需要风险评估”2 组。

要确定代谢产物是否真正值得关切，则需要确定代谢物的暴露程度。由于暴露取决于母药(TGMPCA)中存在的代谢产物和代谢产物的原位产生，因此确定实际暴露水平可能具有挑战性。

如果能充分证明菌株不产生代谢产物(例如通过全基因组测序即WGS 数据)，则无需评估。否则进入代谢产物的暴露途径评估。

如能充分证明代谢产物的原位产生与风险评估无关，则无需评估。若不能，则进入下一步确定潜在的受关切代谢产物是否存在受关切的风险。

通过定性评估能否证明人类或相关的非靶生物(NTO)对代谢产物的暴露在不值得关切的背景暴露水平范围内，若是，则无需评估；否则将其确定为“受关切代谢产物”。

对于所有值得关切的代谢产物(第3 阶段的结果)，说明原位产生是否与风险评估相关，以及代谢产物是否存在于产品中。然后进入第4 阶段。

4.4.4 第4 阶段(步骤16～20)：对受关切的代谢产物(即相关代谢产物)进行风险评估

第4 阶段的风险评估对于以下所有代谢物都是必要的：⑴暴露评估不能证明代谢物与人类和非靶生物无关；⑵所描述的毒理学效应被认为与拟议的用途有关。

所有已确定的对人类和相关非靶生物(即已确定危害的生物)的毒性类型(如急性毒性、遗传毒性)都需要在风险评估中加以处理。

对于风险评估，原则上应遵循微生物和化学活性物质法规和指导文件中指定的相关标准方法。如果这些方法不合适或在技术上不可行，可以考虑以下方法：

⑴暴露评估(暴露的确定)

对于产品中存在的代谢产物造成的暴露，应根据欧洲食品安全局(EFSA)关于农药环境归宿建模和/或操作人员/工人/旁观者/居民的现行指南，酌情进行定量暴露评估。

对于那些没有充分证明原位产生与风险评估无关的代谢产物，通过测量代谢产物在相关环境区域的浓度来确定暴露(例如可食用部分，这将触发需要进行残留试验，如化学农药数据要求所述)。

⑵从文献或毒理学关切阈值(TTC)中确定参考值

是否可以根据现有信息/数据确定相关代谢产物的参考值，若是，进入设置NOAEL/NOEC 和参考值的步骤(见下文)；若否，进入(生态)毒性测试。

毒理学关切阈值(TTC)方法适用于受关切的代谢产物，若是，进入设置NOAEL/NOEC 和参考值的步骤；若否，进入(生态)毒性测试。

⑶根据文献/现有数据确定受关切代谢产物的毒性终点(生态毒理学)

是否可以根据现有文献/数据确定相关非靶标生物组的代谢产物的毒性终点，若是，进入设置NOAEL/NOEC 和参考值的步骤；若否，进入(生态)毒性测试。

⑷NOAEL/NOEC 和参考值的设置

酌情为人类健康设定无可见有害作用水平(NOAEL)/最大无影响浓度(NOEC)及相关群体的参考值包括施用人员允许暴露量(AOEL)/急性参考剂量(ARfD)/每日允许摄入量(ADI)/农药施用人员急性允许暴露量(AAOEL)；对非靶标生物的NOEC/EC50。另外(特别是对于遗传毒性物质)，如果合适，可以使用TTC。

4.4.5 定量风险评估

⑴对人的毒理学风险评估

适当地将暴露量与参考值进行比较。确定所评估的接触组/有机体是否突破了相应的触发值(如传统化学物质)。如果没有突破，则表示该代谢产物存在可接受的风险，更新概述表。如果突破了，即表明该代谢产物存在不可接受的风险，更新受关切代谢物清单。

⑵生态毒理学风险评估

适当地将暴露量与参考值进行比较。确定所评估的接触组/有机体是否突破了相应的触发值(如传统化学物质)。如果没有突破，则表示该代谢产物存在可接受的风险，更新概述表。如果突破了，代表该代谢产物存在不可接受的风险，更新受关切代谢物清单。

该指南已经得到实际应用。2023 年3 月1 日批准有效期至2038 年2 月28 日的微生物农药有效成分绿假单胞菌菌株MA342，评审结果要求该活性成分中存在的具有遗传毒性的代谢物2,3-deepoxy-2,3-didehydro-rhizoxin(DDR)的含量不得超过2 μg/mL。同时要求根据该指南进一步提供有关DDR 的信息，尤其是环境降解速率信息[10]。

5 小结

为了适应欧洲绿色协议和从农场到餐桌战略，欧盟于2022 年修订了微生物农药的登记评审相关法规。在此之前的2020 年欧盟委员会发布了微生物农药中代谢产物风险评价指南。该指南提出了一种实用的逐步评估方法来评估微生物(拟)作为活性物质生产的次生代谢物的相关风险。指南自2021 年11 月1 日起生效。

该指南设计的风险评估程序分4 个步骤。第1 步是确定微生物代谢产物可能需要的评估类型(包括归入化学农药评审、无需进行评审的病毒、需要进一步评审3 种)；第2 步是通过文献检索和试验数据，收集有关微生物及其代谢物的信息，以建立潜在的受关切代谢物列表；第3 步是根据被评估菌株实际产生代谢物的数据，可能的暴露途径和定性风险评估，将潜在的受关切代谢物列表细化为受关切代谢物列表。最后1 步是对每一种确定的受关切次生代谢物进行定性和定量风险评估。