我国微生物农药环境风险评价标准体系构建方法与内容解析

卜元卿，周蓉，袁善奎，虞悦，张圣虎，戴传超，蓝帅

(1.生态环境部南京环境科学研究所，南京210042；2.南京信息工程大学江苏省大气环境与装备技术协同创新中心，南京210044；3.农业农村部农药检定所，北京100125；4.南京师范大学生命科学学院，南京210023)

随着化学农药使用对生态环境和人类健康危害日益显现，削减化学农药使用、开发替代品成为各国环境保护和农业可持续发展的首要任务之一。“十四五”期间，生物农药产业将成为我国新的经济增长点之一，成为保障农业绿色高质量发展的重要生产资料，实现人民生命健康的重要基石。微生物农药是最大的生物农药类型，占全球生物农药产品近90%。微生物农药具有物种资源丰富、不易产生抗药性、环境有毒有害物质残留低等显著特点，是最具潜力和价值的化学农药替代产品。截至2022 年12 月31 日，在有效登记状态的生物农药有效成分有142 个，产品有1900 多个。8 年来生物农药有效成分和产品的年均增长率分别为6.40%和8.83%[1]。

虽然微生物农药的环境友好性一般优于化学农药，具有较好的化学农药替代潜力，且开发应用前景广阔，但其环境安全性并不能因此被忽视。微生物农药进入环境后作为非土著生物，可通过资源竞争或释放毒素改变原生态系统平衡，在杀灭/控制靶标生物的同时，也存在对环境生物产生不良作用的风险，以及危害传播的风险。与化学农药不同，微生物农药通过直接施用或喷洒飘移、雨水冲刷等途径进入环境，其数量受环境条件影响有可能减少，也有可能增加。当环境条件不适宜时，微生物的生命活动受到抑制或引起变异、甚至死亡；当环境条件适宜时，微生物菌株开始生长、繁殖，并发挥其生态作用。而且微生物农药进入环境生物体内后，除了毒性作用外，还具有侵染力，可以在生物体内定殖、繁殖和扩散，突破机体的防御屏障，产生内化作用。由于微生物毒性发生机制、环境暴露途径有其独特性，显著不同于化学农药，因此，微生物农药的环境风险评估程序、评估指标、数据测试方法和评估标准等也不同于化学农药风险评估要求。立足微生物农药特征，建立微生物农药环境风险评价标准技术体系，对防范微生物农药使用的环境风险具有重要作用。

为了加强微生物农药的环境管理，保护生物安全和生态环境，世界各国都加大了生物制剂的环境监管力度。美国、加拿大、日本、欧盟等国家和组织分别建立了微生物农药环境风险评价技术体系，对促进微生物农药产业的健康发展起到了重要作用。然而，长期以来我国微生物农药环境安全风险基础研究薄弱、环境安全管理体系不健全等，导致微生物农药产品创制和产业发展整体滞后于国际发展水平。2017 年《农药管理条例》修订并实施后，新修订的《农药登记管理办法》《农药登记资料要求》《农药登记试验管理办法》等相继颁布。对微生物农药登记资料要求发生了一些变化，包括更加关注微生物农药的环境安全性，提出了有别于化学农药的微生物环境生物毒性试验、增殖试验和环境风险评估登记资料的要求[2]，使我国微生物农药的管理更加规范。

针对我国微生物农药环境安全管理的迫切需求，笔者通过资料调研及研究分析构建了以风险控制为指导思想，涵盖环境生物毒性评价、环境增殖能力评价和环境风险评估的微生物农药环境风险评价标准体系，形成《微生物农药环境风险评价试验准则》、《微生物农药环境增殖试验准则》和《微生物农药环境风险评估指南》系列标准15 项。该标准体系将微生物学、细菌学、遗传学等经典理论灵活应用到微生物农药环境风险评价当中，并将多种微生物环境检测技术进行灵活组合，显著提高方法的科学性、准确性和可靠性，填补了我国微生物农药环境风险管理技术标准空白。

1 微生物农药环境风险评价标准测试方法

《微生物农药环境风险评价试验准则》(NY/T 3152.1—2017～NY/T 3152.6—2017)系列标准共6 项，分别针对6 类不同的环境生物。生态系统中的各类生物都有可能受到微生物农药的影响，但在进行环境风险评价时，不可能对环境中的所有生物开展测试，因此，需要综合考虑生物类群的生态价值、科学价值和经济价值，选择典型的、有代表性的生物类群作为毒性测试的受试生物。另外，微生物农药进入环境后对环境中非靶标生物的不利影响主要来源于微生物菌株的致病性。在试验方法构建时也需要兼顾病原体侵入生物机体的数量、侵袭力、毒力等与微生物菌株致病性相关的因素[3]。通过细菌类微生物农药苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)、真菌类微生物农药球孢白僵菌(Beauveria bassiana，Bb)以及病毒类微生物农药棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nuclear polyhedrosis virus，HaNPV)对不同环境生物的毒性评价研究，建立了相应的标准毒性测试方法[3]。遵循最不利原则，微生物农药环境风险评价毒性测试采用递进式的测试方法，首先进行最不利条件下的最大暴露量试验，若发现有不良影响，再进一步开展剂量验证试验和致死(病)验证试验。由于最大暴露量试验只需设置一组处理组，因此对于不存在非靶标环境生物致死(病)性的微生物农药，首先开展最大危害暴露量试验可大大减少毒性测试的时间及经济成本。

1.1 环境生物指标的选择(基本同现有化学农药)

根据不同生物类群的特点、敏感程度以及生态价值，结合我国《农药登记资料规定》要求，选择6 大类典型的、有代表性的生物作为毒性测试的受试生物。

1.1.1 水生生物指标

水生态系统中，鱼类是一个重要组成部分，处于水生食物链的顶端，摄食初级生产者和水生无脊椎动物，对维护水生生态系统的完整性和稳定性具有重要作用，而且我国鱼类物种丰富，且鱼类具有药用、食用等经济价值。溞类是作为初级消费者，对维护水生态系统功能和水环境质量也具有重要作用。藻类是地球上最重要的初级生产者，其物种多样性及丰富度直接影响水生态系统的结构和功能。而且溞类和藻类对于毒性物质都具有较高的敏感性。因此，选择鱼类、溞类和藻类作为微生物农药对水生生态环境影响的生物指标。

1.1.2 陆生生物指标

陆生生态系统中，鸟类参与生态系统内能量流动和无机物质循环，对森林、草原、农田、湖泊、海洋等生态系统的稳定都具有维持作用，而且我国是鸟类资源最为丰富的国家。蜜蜂是对人类有益的昆虫类群之一，它既采花酿蜜，又传授花粉，具有重要的经济价值和社会价值。家蚕是我国特有的一种重要经济昆虫，在农业生态系统中对农药十分敏感，又是非靶标生物的代表物种之一。因此，选择鸟类、蜜蜂和家蚕作为微生物农药对陆生生态环境影响的生物指标。

1.2 毒性测试方法的建立

根据微生物农药的特点以及环境生物的特性，分别建立了6 类环境生物的毒性试验的标准测试方法。

1.2.1 暴露途径

微生物农药对环境生物产生毒性需满足2 个条件，一是对环境生物具有暴露的可能，二是对环境生物具有致死或致病的能力。因此，在进行微生物农药毒性评价时，首先应确定其暴露途径。微生物农药通过施用进入环境后，可通过皮肤、食物、饮用水等多种途径进入生物体，而且微生物菌株种类繁多，致病途径因种类而异，因此，评价微生物农药的毒性时暴露途径的选择尤为重要。

对于水生生物来说，整个生命周期均暴露于水环境中，因此接触暴露是最为重要的暴露方式。另外，鱼类还有可能会摄食迁移进入水体中被微生物农药感染的昆虫，因此还需要考虑经口暴露途径。

对于陆生生物，暴露途径的设置主要参考美国、加拿大、日本等国家微生物农药毒性试验暴露途径要求。鸟类根据微生物农药菌株特性和使用方式选择经口饲喂或腹腔注射作为暴露途径。蜜蜂则根据微生物农药的种类选择经口或接触的暴露途径。家蚕以经口暴露途径为主，采用浸叶法进行试验。

1.2.2 试验周期

微生物菌株通过不同的暴露途径侵入生物体后，可能会存在一定时期的潜伏期，因此，与化学农药相比，微生物农药对环境生物的毒性试验需要更长的试验周期。参考美国、加拿大、日本微生物农药环境安全性评价试验要求，结合用于试验的受试生物的生命周期，确定水生生物鱼类的试验观察时间持续30 d，溞类的试验观察时间持续21 d，藻类的试验观察时间持续96 h。陆生生物鸟类的试验观察时间持续30 d，蜜蜂的试验观察时间持续14 d，家蚕的试验观察时间没有明确的天数要求，根据家蚕的发育情况，从2 龄起至家蚕化蛹。但是对于鱼类、溞类、鸟类和蜜蜂，当受试生物在以上规定的试验周期结束时，开始出现死亡、活动抑制等毒性效应或明显病征，则需延长观察时间，直至确定最终的影响。

1.2.3 最大危害暴露量试验

微生物农药中的微生物菌株进入环境后，除了会侵入环境生物体内，还有一部分会暴露在环境当中，并在环境中传播及增殖，最大危害暴露量试验的设置考虑了风险最大可能性发生时的最不利影响，包括具有一定数量和足够毒力的微生物以及适宜的入侵途径；处于易感性的敏感生物；具有可促使微生物侵入易感动物的外界条件，同时考虑了潜伏期(从暴露到感染和染病的时间)、免疫力(正常的和受损的)的影响。如果环境生物暴露于最大剂量微生物农药时，未发生不良影响，则可以认为微生物农药在使用中不会产生不良影响。微生物农药最大危害暴露量(表1)的设置主要参考美国微生物农药毒性测试方法[4-9]，考虑的因素包括物种特征、暴露途径和微生物农药在水中的溶解度等。由于美国微生物农药测试的环境生物不包括水生生物藻类和陆生生物家蚕，因此这2 种生物的最大危害暴露量分别参照水生生物鱼类和溞类，以及陆生生物蜜蜂相应暴露途径的最大危害暴露量。

表1 微生物农药最大危害暴露量

试验开始后，每日观察受试生物的死亡情况及毒性症状，当试验周期结束时，有50%的个体死亡或致病时，则需要进一步开展剂量效应毒性试验。

1.2.4 剂量效应毒性试验

剂量效应毒性试验的目的是评价微生物菌株在系列环境暴露浓度下对环境生物的影响，以确定微生物与环境生物之间的毒性剂量效应关系。剂量效应毒性试验系列浓度的设置依据最大危害暴露量试验结果，按一定比例间距设置5～7组暴露浓度，用以确定微生物农药对不同环境生物的半数致死量(LD50/LC50)、半数感染量(ID50/IC50)、半数效应浓度(EC50)。

1.2.5 致死(病)验证试验

微生物对生物群体发生危害的必要条件主要有易感群体、致病性(毒力)和环境传播能力。针对微生物农药生物体内存活和繁衍对宿主的危害，以微生物学经典理论科赫氏法则为依据，建立了传统稀释平板菌落计数法、血球计数板法与荧光定量PCR法相结合的微生物农药环境生物致病性测试方法。试验时可根据微生物类型和特性选择合适的方法。细菌可采用稀释平板菌落计数法结合荧光定量PCR法，真菌可采用稀释平板菌落计数法和血球计数板法，原生动物可选择血球计数板法，病毒可采用血球计数板法和荧光定量PCR 法。

2 微生物农药环境增殖标准测试方法

《微生物农药环境增殖试验准则》(NY/T3278.1—2018～NY/T3278.3—2018)系列标准共3 项，分别针对3 类不同的环境介质，目的是要通过测试证明微生物菌株在环境中宿存或繁殖、复制的能力。微生物农药施用后除了少部分作用于靶标生物外，大部分进入土壤、水、空气、植物叶面等环境介质中。微生物菌株与不同环境介质之间存在复杂的相互作用，各种环境因素会不同程度地影响微生物菌株在环境中的生长和繁殖。因此，微生物农药环境增殖标准测试方法的建立需选择具有代表性的环境介质，并考虑影响微生物菌株生长繁殖的各种环境因素。

2.1 环境介质的选择

我国幅员辽阔，不同地区气候条件、土壤类型、耕作方式等都存在显著差异，因此，选择合适的、具有代表性的环境介质对评价微生物农药的环境增殖能力具有重要意义。

通过系统研究典型微生物农药在不同类型土壤(东北黑土、陕西黄绵土和褐土、河北棕壤、江西红壤、江苏水稻土等)，自然水体(河水、湖水)，植物叶面(蜡质、毛质)中的宿存和消长动态，以风险评价最坏场景构建为宗旨，结合我国主要作物生产区，提出我国微生物农药环境增殖评价的代表性环境介质。

针对土壤介质，推荐使用总有机碳含量较高的黑土作为试验用土，也可以根据微生物农药的使用范围选择拟施用地区的土壤作为试验用土，土壤的含水量要达到最大田间持水量的40%～60%。针对水环境介质，推荐使用配制水作为试验用水，根据自然水体分析研究结果提出了试验用水的配方，且配制水在使用前需要通过高压蒸汽灭菌处理。针对植物叶面，综合考虑植物的经济和生态价值推荐的试验用植物为棉花，也可以选择微生物农药登记作物或其他具有重要经济价值或生态价值的植物叶片。

2.2 接种量

研究结果显示，在特定环境介质中，不同剂量处理下微生物农药菌株苏云金芽孢杆菌(Bt)的整体消长规律基本类似，说明Bt 在土壤中的消长情况与初始种群数量关系较小[3]。因此，以108CFU/mL作为供试物初始接种浓度，若供试物不能达到108CFU/mL可以根据推荐使用量计算菌株接种浓度。

2.3 培养条件

微生物增殖是菌株与外界环境因素共同作用的结果。环境中的物理、化学因素对微生物形态、生理、生长、繁殖等特征均有影响，当环境条件超过一定极限，甚至会诱导微生物的死亡。因此，为尽量降低试验过程中环境因素的影响，要按照微生物菌株最佳生长条件设立培养温度、湿度、氧气、光照等培养参数。

2.4 试验周期与取样

微生物农药环境增殖试验的试验周期要能够反映供试物在环境介质中的宿存、繁衍和衰亡情况，或在28 d 内持续检测到供试物数量维持稳定或低于初始接种量，可结束试验。试验过程中根据环境微生物生长一般规律设置取样量和取样时间，通常自接种后开始取样，前4 d 每天取样，4 d 后每隔1 d取1 次样，也可根据受试物的具体生长情况调整取样量和取样间隔时间。

2.5 计数方法

通过深入研究抗生素突变体标记法、绿色荧光蛋白基因标记法、特异性基因荧光检测法、基于核酸染色的DAPI 法、基于特异性基因的SCAR 分子标记法、基于特异性蛋白ELISA 检测法等微生物分子检测技术的适用范围、灵敏性和稳定性，结合不同类型微生物菌株特征和环境介质类型细化分类，建立了稀释平板菌落计数法、绿色荧光蛋白基因标记法、特异性基因荧光定量PCR 法、直接计数法等多种准确、可靠的环境微生物检测技术组合。试验时可根据微生物类型和计数单位要求选择合适的方法。细菌、放线菌、真菌、酵母以CFU为计数单位时，可采用稀释平板菌落计数法、绿色荧光蛋白基因标记-平板计数法测定，以基因拷贝数为计数单位时，可采用分子标记-荧光定量PCR法。原生动物、真菌孢子、酵母通常以个体数为计数单位，可采用直接计数法测定。根据计数结果绘制供试物的生长-消亡曲线。

3 微生物农药环境风险评估标准技术方法

《微生物农药环境风险评估指南》(NYT 4197.1—2022～NYT 4197.6—2022)系列标准共6 项，分别为总则和针对鱼类、溞类、鸟类、蜜蜂和家蚕等保护目标的评估。该套评估指南充分比较了国外微生物农药环境风险评估的程序、方法(表2)，其中家蚕属于我国特有经济动物，除日本有相关要求外，国外暂无微生物农药对家蚕环境风险评估相关标准。评估采纳阶段递进评估程序，以最大危害暴露量评估-危害效应和环境增殖-高级生命循环影响-中宇宙或小规模野外模拟为评价路线，以毒性效应评价和增殖能力评价为核心，建立了从简单、保守到复杂、现实的四阶段微生物农药风险评估程序，包括初级评估(第一阶段和第二阶段)、高级评估(第三阶段和第四阶段)(图1)，实现科学、准确、规范、可靠和经济的目标。

图1 微生物农药环境风险评估程序

表2 本标准与其他国家准则的比较

3.1 问题阐述

问题阐述包括风险估计、数据收集和评估计划简述等内容要求。根据微生物农药生物学特征、防治对象等确定对保护生物危害的可能性，当根据现有信息不能排除保护生物受到微生物农药的暴露危害时，通过收集微生物农药生物学、生态毒理、环境繁衍、制剂组成及使用方法等方面的信息开展风险评估。针对用于多种作物或多种防治对象的微生物农药，要求根据每种作物或防治对象的施药方法、施药量或频率、施药时间等的不同，对其使用方法进行分组评估，从而明确何种条件下该微生物农药对保护生物的风险可接受。

3.2 第一阶段(最大危害暴露量评估)

微生物侵入生物机体，并在生物体某一部位定殖、生殖和繁殖，从而引起生物机体的病理反应。这种病理反应不仅取决于微生物的致病力和毒力，还与感染生物的遗传易感性、机体的免疫状态和环境因素有关。识别微生物感染和传染的发生是评估微生物农药环境风险的首要关键。第一阶段根据微生物农药环境生物毒性测试最大危害暴露试验的结果进行评估，以对50%个体具有毒性或致病性作为是否开展第二阶段评估的依据。

3.3 第二阶段(危害效应和环境繁衍)

如果在第一阶段最大危害暴露量评估显示对保护对象有不可接受的风险，则要进行第二阶段测试和评估，包括剂量-效应、致死(病)验证和环境繁衍等测试，从易感群体、致病性(毒力)和环境传播能力进行风险评估。在危害效应评估中不仅考虑了暴露和剂量-效应的潜伏期、免疫力，还通过致死(病)性试验测试了在群体中二次传播的影响。

3.3.1 环境繁衍

根据微生物在土壤、水或植物叶面的存活率及分布，能进一步描述微生物的暴露和浓度。由于目前微生物环境暴露和浓度数据十分有限，因此采用土壤、水或植物叶面中检测到的微生物数据用以评估环境风险。

3.3.2 初级风险表征

⑴如果剂量效应模型符合指数模型或泊松分布模型，风险表征可采用风险商值(RQ)进行定量描述：RQ≤1，即环境暴露浓度低于或等于危害效应终点，则风险可接受；RQ＞1，即环境暴露浓度高于危害效应终点，则风险不可接受。⑵如果剂量效应模型符合单击、非阈值模型，风险标准可采用定性描述：如微生物农药在水体中无生长能力，则风险可接受；如微生物农药在水体中有生长能力，则风险不可接受。

3.4 第三阶段(高级生命循环影响评估)

微生物对保护对象的危害可以分为个体、种群、群落，同时根据传播途径不同还存在水平传播和垂直传播2 种方式。水平传播是指在群体之间或个体之间以水平形式横向平行传播，又可以分为直接接触传播和间接接触传播。直接传播是指不需要任何外界因素参与，微生物传染通过直接接触(交配、抓咬等)引起易感生物感染的传播方式，通常形成明显的传播链但不会造成大规模流行。间接传播是必须在外界因素参与下，如经过污染的水、食物、空气、土壤或生物传播。垂直传播是指从母体到其后代2 代之间的传播，包括经卵传播、经胎盘传播和经产道传播。高级生命周期试验的目标是研究微生物农药对保护对象个体或种群的持续性影响和影响程度。

3.5 第四阶段(中宇宙或小规模野外试验)

利用中宇宙系统或小规模野外试验体系(核心区和防护区总面积不超过10 hm2，其中核心区面积不超过10%，且核心区与防护区呈同心圆分布)，评估微生物农药正常使用下对保护目标食物链、生态系统的影响，重点包括危害影响、传播范围、影响程度和持续时间等。

4 结论

微生物农药环境风险评价系列标准的制订进一步完善了我国生物农药环境安全评价技术体系，通过微生物农药登记前环境风险评价，从源头控制微生物农药对环境可能产生的危害。风险评估程序、方法和评判的标准化、规范化，可保证评估结果的准确性、可靠性和一致性，对于规范我国微生物农药环境风险评估工作，使之适应新形势的要求，从而更好地为我国的农药登记和农药环境管理提供技术支持具有重要意义。